王 娜，孫 娟，，石利利＊，吉貴祥，陳國松

（1.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京 210042；2.南京工業(yè)大學理學院，江蘇 南京 210044）

毒死蜱（chlorpyrifos）是我國生產(chǎn)和使用量都非?？捎^的一種廣譜有機磷殺蟲劑［1］。毒死蜱被人體吸收后，主要分布在肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官，經(jīng)脂酶分解成一系列代謝產(chǎn)物，包括二乙基-硫代磷酸酯（diethyl thiophosphate，DETP）、二乙基-磷酸酯（diethyl phosphate，DEP）和3，5，6-三氯-2-吡啶醇（3，5，6-trichloro-2-pyridinol，3，5，6-TCP）［2］，結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究［3］表 明，3，5，6-TCP是毒死蜱在人體中經(jīng)腎臟排泄的最主要的代謝產(chǎn)物。因此，人尿液中3，5，6-TCP的濃度是人體毒死蜱生物負荷的一個特異性生物監(jiān)測指標，可反映毒死蜱這種外源性污染物質(zhì)對人體產(chǎn)生的危害，如抑制人體紅細胞乙酰膽堿酯酶活性以及導致血色素濃度下降等［4］。

圖1 （a）毒死蜱、（b）3，5，6-TCP、（c）DETP和（d）DEP的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of（a）chlorpyrifos，（b）3，5，6-TCP，（c）DETP and（d）DEP

目前，3，5，6-TCP的測定大都是以血漿或尿液為基質(zhì)。儀器分析方法包括氣相色譜（GC）法［5］、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法［3，6］、高效液相色譜（HPLC-UV）法［7，8］、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法［9］等。運用GC法時，前處理時需要對3，5，6-TCP進行衍生化，合成易于氣化的產(chǎn)物。衍生化過程不僅繁瑣而且具有重現(xiàn)性差的缺點。運用HPLC-UV法時，紫外檢測器的非特異性制約了整個分析方法的靈敏度，同時對生物樣品的凈化提出了非常嚴格的要求，否則極易出現(xiàn)假陽性。有文獻［2］報道運用LC-MS／MS法測定尿液中3，5，6-TCP，定量限高達0.25mg／L，所以只能用于毒死蜱急性中毒的鑒定，無法用于毒死蜱的人體健康風險暴露評估以及其生物負荷的痕量監(jiān)測。因此，建立毒死蜱的主要代謝產(chǎn)物3，5，6-TCP在人尿中的痕量分析技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。

本研究采用溶劑萃取前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS），建立了人尿液中3，5，6-TCP的分析測定方法。方法操作簡單、靈敏度高、準確性好、重現(xiàn)性強，并已成功應(yīng)用于人尿液實際樣品中3，5，6-TCP的測定，取得了滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Quattro Premier XE質(zhì)譜儀（美國 Waters公司）；AG-285電子天平（瑞士 Mettler公司）；MG-2200氮吹儀（日本EYELA公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；WH-3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司）；高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

3，5，6-TCP和酮洛芬標準品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇均為色譜純，德國Merck公司。

1.2 標準工作溶液的配制

分別稱取10mg（精確至0.1mg）3，5，6-TCP和酮洛芬標準品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1000mg／L的標準貯備液，避光保存于4℃。用甲醇稀釋標準貯備液至不同濃度，配制標準工作液。

1.3 樣品前處理

準確吸取尿液10.0mL置于125mL分液漏斗中，加入內(nèi)標物酮洛芬20μL（100mg／L）。加入20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶80，v／v）溶液，充分振搖萃取，重復一次。上清液移至雞心瓶，旋蒸濃縮至約2mL，用移液器移至試管中。用提取溶劑清洗雞心瓶2～3次，合并至試管中。于40℃水浴中氮氣吹干，殘留物以200μL的10%（體積分數(shù)）乙腈-水溶液渦旋30s溶解，經(jīng)0.22μm膜過濾后待UPLCMS／MS分析。

1.4 UPLC-MS／MS條件

1.4.1 UPLC條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1mm，1.7μm）；流動相A為乙腈，B為水。流動相的梯度洗脫程序為:0～2min，20%A～30%A；2～3min，30%A～40%A；3～4min，40%A；4～5min，40%A～30%A；5～6min，30%A～20%A。流速為0.3mL／min；柱溫為25℃；進樣量為5μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用負離子模式的電噴霧電離（ESI-）；SIR（selective ion recording）方式掃描；毛細管電壓:3.5 kV；離子源溫度:120℃；脫溶劑氣溫度:350℃；錐孔反吹氣流量:50L／h；脫溶劑氣流量:600L／h；萃取器電壓:3.0V；RF透鏡電壓:0.2V；低端分辨率1:15.0；低端分辨率2:15.0；高端分辨率1:15.0；高端分辨率2:15.0；離子能量1:0.5；離子能量2:0.5；碰撞氣壓力:0.343Pa；3，5，6-TCP定量離子:m／z198，定性離子:m／z196；酮洛芬定量離子:m／z 253.12；離子駐留時間:0.5s；錐孔電壓:-30V。

2 結(jié)果與討論

2.1 空白基質(zhì)的選擇

采用人工合成尿液進行試驗，雖然本底較為干凈，但是其中不含蛋白質(zhì)，與實際尿液有一定的差距，不能有效反映人實際尿液基質(zhì)的復雜性。而采用小鼠尿液作為空白基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其存在較高的本底值，不適合測定方法的建立。因此，本實驗通過對不同人的尿液進行篩選，選擇無3.5.6-TCP干擾的人尿液作為空白基質(zhì)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的選擇

尿液是內(nèi)源性物質(zhì)較多的復雜生物基質(zhì)，目前報道的尿液中有機物的痕量分析前處理大多采用固相萃取法（SPE）［10，11］。對于小鼠和人尿液中3，5，6-TCP的分析測定，有報道采用液液萃取法［7，8］。因此，本研究對固相萃取法和液液萃取法分別進行了嘗試。分別使用極性較大的C8小柱（200mg，6 mL，美國 Waters公司）、Florisil小柱（500mg，6 mL，美國ProElut公司）和 HLB小柱（200mg，6 mL，美國 Waters公司）對尿液中的3.5.6-TCP進行提取，結(jié)果均未提取出來。這可能是因為在固相萃取過程中固相填料對3.5.6-TCP的吸附力不夠大，當尿液樣本通過吸附劑床時，3，5，6-TCP未能在其表面吸附。而選用有機溶劑液液萃取法進行前處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯可以將待測物3，5，6-TCP提取出來，但提取回收率并不是特別高。

2.2.2 提取溶劑的選擇

分別用乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）和乙酸乙酯-乙腈（70／30，v／v）溶液作為尿液樣本的提取溶劑，考察不同提取溶劑對待測物的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液對待測物的提取回收率最高。由于3，5，6-TCP具有羥基結(jié)構(gòu)，于是考察了酸化提取對回收率的影響。酸化提取中，加入一定量的濃鹽酸調(diào)節(jié)尿液樣本pH達到4，再用二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液進行液液萃取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸化提取并未大幅度提高待測物的提取回收率，因此最終選用二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液進行中性提取，這與3，5，6-TCP的pKa7.5的理化性質(zhì)相一致［2］。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用ESI方式，分別考察了ESI／全掃描（full scan）在正、負離子模式下待測物峰的響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在負離子模式下3，5，6-TCP的基峰為［MH］-峰（m／z 198），而在正離子模式下未找到明顯的碎片離子峰。運用子離子掃描（daughter scan）模式，以m／z198為母離子，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)穩(wěn)定且較強的碎片峰，這也與3，5，6-TCP的結(jié)構(gòu)相符。因此，待測物的質(zhì)譜檢測定量離子為SIR模式下的m／z198。

在上述 UPLC-MS／MS 測定條件下，3，5，6-TCP和內(nèi)標酮洛芬的保留時間分別為3.93和4.80 min，空白尿液樣品無干擾?？瞻啄蛞骸⒓訕藰悠泛蛯嶋H樣品的典型色譜圖如圖2所示。

圖2 （a）空白尿液、（b）加標尿液和（c）實際尿樣的色譜圖Fig.2 Chromatograms of（a）a blank urine sample，（b）a spiked urine sample and（c）a real urine sample

2.4 工作曲線、檢出限和定量限

精密吸取3，5，6-TCP標準工作液添加到10 mL空白尿樣中，使尿液樣本中3，5，6-TCP的質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mg／L。按1.3節(jié)前處理方法進行操作，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下分析，記錄3，5，6-TCP色譜峰面積（As）與內(nèi)標色譜峰面積（Ar）。3，5，6-TCP與內(nèi)標的峰面積比 R （R＝As／Ar）對質(zhì)量濃度（C，mg／L）進行線性回歸，回歸方程為R＝0.09456C-0.00174，r2＝0.998。3，5，6-TCP在0.005～0.4 mg／L范圍內(nèi)色譜響應(yīng)線性關(guān)系良好。在空白基質(zhì)中添加目標化合物，以目標化合物3倍信噪比的加標水平為LOD，平行測定5次；以目標化合物10倍信噪比的加標水平為LOQ，平行測定5次。方法的LOD為0.41μg／L，LOQ為5μg／L。

2.5 加標回收率和精密度

配制質(zhì)量濃度為10、20和200μg／L的3，5，6-TCP空白加標尿液樣本各3份，分析結(jié)果如表1所示，3，5，6-TCP的平均回收率為95.33%～99.80%，相對標準偏差為1.60%～9.86%。

表1 3，5，6-TCP在尿液中的添加回收率（n＝3）Table 1 Recovery of 3，5，6-TCP spiked in a human urine sample（n＝3）

配制3，5，6-TCP 質(zhì)量濃度為10、20和200 μg／L的空白加標尿液樣本，按已確定尿液樣品處理方法，同樣操作、測定以及計算。在一個分析日內(nèi)測定5次，計算日內(nèi)精密度；在不同分析日（5d）制備并測定3個批次加標樣本，計算日間精密度。結(jié)果表明，對尿液樣品中3，5，6-TCP的分析精密度良好，RSD均小于15%（見表2）。

表2 日內(nèi)和日間精密度試驗數(shù)據(jù)Table 2 Results of intra-and inter-day precision tests

2.6 實際樣品的處理和分析

采集了某農(nóng)藥廠附近居民的晨尿40份，包括幼齡兒童（20份）及其父親或母親的尿液。按1.3節(jié)實驗方法處理樣品，測定結(jié)果如表3所示。

表3 兒童和成人的尿液中3，5，6-TCP的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of 3，5，6-TCP in children’s and adults’urine

結(jié)果表明，半數(shù)的兒童尿液中檢出3，5，6-TCP，最高檢出質(zhì)量濃度為72.23μg／L；1／3的成人尿液中檢測出3，5，6-TCP，最高檢出質(zhì)量濃度為83.50μg／L，反映出毒死蜱的人體生物負荷水平。毒死蜱的人體內(nèi)暴露一方面可能與農(nóng)藥廠周邊人群吸入了含有毒死蜱的大氣有關(guān)，另一方面可能與食用了含毒死蜱殘留的農(nóng)作物有關(guān)。

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，用于分析人體尿液中毒死蜱主要代謝產(chǎn)物3，5，6-TCP。驗證結(jié)果表明該方法操作簡單，靈敏度、準確度、精密度和定量分析線性關(guān)系均良好，已成功應(yīng)用于實際測定某農(nóng)藥廠附近居民尿液中3，5，6-TCP的含量。該方法可以為毒死蜱的人體健康風險暴露評估以及其生物負荷的痕量監(jiān)測提供有效的方法支撐，同時為揭示毒死蜱在體內(nèi)的代謝方式和暴露途徑，科學評價毒死蜱暴露水平與其代謝物之間的關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

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