韓云麗，陳喜明，高克昌，程 丹

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000）

1986年中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所的余增亮發(fā)現(xiàn)離子束注入水稻的生物學(xué)效應(yīng)，為離子束生物工程的興起揭開了序幕。其作用機(jī)理是將離子注入作物種胚和生長(zhǎng)點(diǎn)，通過能量輸入、動(dòng)能傳遞、粒子植入、電荷交換，誘導(dǎo)作物發(fā)生可遺傳變異[1]。

目前，離子注入已被廣泛應(yīng)用于作物品種的選育與改良，并在轉(zhuǎn)基因及遠(yuǎn)緣雜交上得到應(yīng)用[2-6]。劉志生等[7]利用2.0 MeV氦離子注入獲得了比玉米自交系478早熟23 d的自交系和籽粒產(chǎn)量特高的自交系。李玉峰等[8]對(duì)N+注入介導(dǎo)大豆基因組DNA轉(zhuǎn)入紫花苜蓿進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，M2總性狀突變率達(dá)到19.8%，并得到3株葉片粗蛋白含量比對(duì)照高約0.5%的突變株、1株葉綠素含量比對(duì)照高33.3%的突變株。

離子注入技術(shù)應(yīng)用于作物領(lǐng)域，具有損傷輕、突變率高和突變譜廣等特點(diǎn)，并已被大量試驗(yàn)證明。但多項(xiàng)研究表明，誘變劑量、不同的作物以及同一作物的不同品種對(duì)誘變的響應(yīng)不盡相同[9-15]。小扁豆（Lens calinaris Medik，2n＝2x＝14）又名冰豆、雞眼豆等，是世界上第7大食用豆類作物，抗寒、耐旱，在我國(guó)北方地區(qū)有較悠久的種植歷史。近年來(lái)，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，小扁豆以其重要的食療保健作用倍受青睞，與之相關(guān)的育種技術(shù)也正受到育種家的關(guān)注，但與育種相關(guān)的種質(zhì)資源狹窄問題一直是制約育種發(fā)展的瓶頸。離子注入小扁豆的研究報(bào)道甚少，尚未見有N+注入小扁豆的研究。

本試驗(yàn)對(duì)不同劑量N+注入小扁豆的誘變效應(yīng)進(jìn)行了研究，將對(duì)小扁豆種質(zhì)的創(chuàng)新及新品種選育具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 植物材料和輻射處理

LD40，LD56這2個(gè)小扁豆品系是分別從地方品種右玉小扁豆和寧武小扁豆中單株連續(xù)定向選育的新品系，均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所小雜豆課題組育成。試驗(yàn)從這2個(gè)品系風(fēng)干種子中分別挑選其大小均勻、籽粒飽滿、無(wú)破損、無(wú)霉菌污染的籽粒作為試樣。部分試樣留存作為空白對(duì)照，剩余種子于2010年4月在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心經(jīng)能量為60 keV的N+注入，注入劑量分別為 2.0×1016，4.0×1016，6.0×1016，8.0×1016，1.0×1017N+/cm2。

1.2 試驗(yàn)方法

2010年4月22日，把經(jīng)各劑量N+注入的種子及未注入N+的種子共12份材料播種于大田。每次處理均取300粒種子，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每小區(qū)5行，行長(zhǎng)1 m，行距33 cm，共36個(gè)小區(qū)。調(diào)查M1出苗率，篩選出明顯的變異單株（指2個(gè)或2個(gè)以上性狀發(fā)生變異的單株，考察性狀主要有株高、單株分枝數(shù)、花色、單株莢數(shù)、生育期和單株產(chǎn)量）。

2011年4月20日，將M1篩選出的明顯變異單株分別種成株系，并從上代無(wú)表型變異的混收材料中隨機(jī)抽取100粒種植2行，以觀察后代變異情況。突變頻率用出現(xiàn)的突變株占觀察總個(gè)體數(shù)的比例來(lái)估算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DPS 6.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和多重比較，其中，多重比較中，用A～E表示0.01水平上的差異顯著情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入對(duì)小扁豆出苗率的影響

由表1可知，LD40，LD56這2個(gè)小扁豆品系的對(duì)照出苗率分別為94.1%和90.3%；與對(duì)照相比，不同劑量N+注入對(duì)2個(gè)小扁豆品系出苗率均出現(xiàn)誘變效應(yīng)，且誘變效應(yīng)基本一致，2.0×1016，4.0×1016N+/cm2劑量對(duì)小扁豆的出苗率有一定的提升作用，但與對(duì)照相比差異不顯著，且2個(gè)劑量間差異不顯著；6.0×1016，8.0×1016，1.0×1017N+/cm2這 3 個(gè) N+離子注入劑量中，隨著劑量的逐步增加，小扁豆出苗率直線下降，LD40，LD56的出苗率3個(gè)劑量依次下降為75.1%，62.3%，42.8%和74.0%，61.3%，40.7%。多重比較表明，這3個(gè)劑量處理與對(duì)照間差異極顯著，且3個(gè)劑量間差異也達(dá)極顯著水平。適當(dāng)?shù)淖⑷雱┝靠梢源龠M(jìn)不同品種小扁豆田間出苗。

表1 N+注入對(duì)小扁豆出苗率的影響

2.2 N+注入小扁豆引發(fā)的遺傳變異情況

表2為N+注入不同劑量處理對(duì)2個(gè)小扁豆品系M1田間變異統(tǒng)計(jì)。

表2 N+注入田間小扁豆變異株統(tǒng)計(jì)及多重比較

根據(jù)小扁豆株高、單株分枝數(shù)、花色、單株莢數(shù)、生育期和單株產(chǎn)量等主要性狀，篩選出的2個(gè)或2個(gè)以上性狀發(fā)生變異的單株確認(rèn)為是明顯變異的單株，結(jié)果表明，不同處理的2個(gè)品系當(dāng)代的田間觀察中均發(fā)現(xiàn)變異株。變異主要表現(xiàn)在葉片變厚、變大，葉面皺縮，豆莢變長(zhǎng)變短，莖稈出現(xiàn)畸形，熟期變晚等性狀。并隨著N+劑量的加大，各品系變異株率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。多重比較結(jié)果表明，品系內(nèi)各劑量處理間的變異株率差異極顯著，2個(gè)小扁豆品系間的變異株率差異極顯著。

對(duì)不同劑量處理的2個(gè)品系M2田間觀察顯示，有些植株當(dāng)代出現(xiàn)的變異在M2出現(xiàn)分離，也有些植株雖在誘變當(dāng)代出現(xiàn)變異但在下一代又恢復(fù)了原來(lái)品種的特征特性，可能原因是作物自身的調(diào)節(jié)能力對(duì)外界的傷害有一定的修復(fù)功能；M2有些植株仍然保持M1的變異性狀，說(shuō)明誘變當(dāng)代產(chǎn)生的表型變異在后代是部分遺傳的。

3 討論

孫蘭弟等[16]對(duì)不同劑量的C+輻照小扁豆進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，輻射后小扁豆M1不同劑量下的出苗率和對(duì)照間相差很小，但90 Gy劑量輻照有利于其生長(zhǎng)；M2發(fā)芽率降低，30 Gy劑量輻射長(zhǎng)勢(shì)較好。本試驗(yàn)低劑量N+間小扁豆出苗率差異不顯著，而高劑量N+間小扁豆出苗率差異極顯著。這可能是由不同N+注入及其劑量高低對(duì)同一作物的響應(yīng)不同所致。試驗(yàn)中各處理間出苗率的差異可能主要由誘變處理與品種的不同基因型互作所致。

陳冬花等[17]對(duì)擬南芥種子引起M1和M2變異的遺傳分析認(rèn)為，N+注入劑量在5×1013～5×1015N+/cm2范圍內(nèi)，DNA的變異頻率隨著劑量的增加呈明顯的上升趨勢(shì)，與本試驗(yàn)不同劑量N+對(duì)小扁豆變異的誘變效果基本一致。

低劑量處理雖能保持或提高種子的發(fā)芽率，但創(chuàng)造的變異有限；而為提高誘變變異效果，加大誘變劑量又會(huì)使誘變過程中種皮受損嚴(yán)重，這可能是導(dǎo)致誘變處理后出苗率較低的重要原因之一。

適宜的誘變劑量既能保證足夠的植株成活率，又能誘發(fā)出較多的突變類型和較高的突變頻率，是植物輻射誘變育種成功的關(guān)鍵因素之一。預(yù)測(cè)適宜輻射誘變劑量的方法有LD50（半致死劑量）、HD50（半致矮劑量）和VID50（活力指數(shù)下降50%的劑量）等，但一般以LD50作為輻射育種中適宜誘變劑量的參考[18-21]。本試驗(yàn)僅對(duì)小扁豆的N+注入誘變效應(yīng)進(jìn)行初步研究，如對(duì)HD50進(jìn)行研究或分析，可得出N+注入小扁豆的最佳輻射劑量，這還有待進(jìn)一步研究。

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