王文斌，王 琳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

紫花苜蓿是世界上種植面積最大，應(yīng)用最為廣泛的豆科牧草，素有“牧草之王”的美稱，產(chǎn)業(yè)化市場(chǎng)前景廣闊[1-3]。其不僅富含蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)[4-6]，而且其發(fā)達(dá)的根系還具有防風(fēng)固沙和保持水土等重要的生態(tài)功能[7-8]。但是干旱、鹽漬等多種逆境限制了它的推廣和應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外已有將外源基因?qū)胱匣ㄜ俎＋@得再生植株的報(bào)道，而異源目的基因的高效遺傳轉(zhuǎn)化有賴于植物高頻再生體系的建立[9-10]。在植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，通過(guò)愈傷組織再生植株的方法，有利于保持原有品種的優(yōu)良性狀，再通過(guò)轉(zhuǎn)移控制特定性狀的目的基因，從而達(dá)到改良其品質(zhì)或其他特性的目的。

本試驗(yàn)以新疆大葉和新牧一號(hào)苜蓿下胚軸、子葉為材料，研究不同基因型、外植體、培養(yǎng)基及激素配比對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響，旨在建立針對(duì)這2個(gè)品種的高頻轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，為苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種為新疆大葉（Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye）、新牧一號(hào)（Medicago sativa L.cv.Xinmu No.1），均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)工程學(xué)院張博教授惠贈(zèng)。試驗(yàn)采用5 d苗齡的紫花苜蓿無(wú)菌苗子葉和下胚軸為外植體。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

1.2.1 主要試劑 SH鹽，使用濃度為3183.25mg/L；SH維生素，使用濃度為1 010.5 mg/L；MS，含MS鹽和維生素，使用濃度為 4 405.19 mg/L；2，4-D，用少量95%乙醇溶解后加蒸餾水配制成1 mg/mL貯備液，4℃保存；KT，BAP，NAA，IBA，分別用少量 1 mol/L KOH溶解后加蒸餾水配制成1 mg/mL貯備液，4℃保存；以上試劑均購(gòu)自Sigma公司。

1.2.2 基本培養(yǎng)基 試驗(yàn)以MS（含MS鹽和MS維生素）和SH（含SH鹽和SH維生素）為基本培養(yǎng)基；進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)、分化和生根時(shí)，分別添加不同濃度的植物生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素，附加30 g/L蔗糖、7 g/L植物瓊脂；1/2 MS培養(yǎng)基中，MS成分減少1/2，其他成分不變。所有培養(yǎng)基的pH值均為5.7，121℃高壓滅菌15 min，分裝備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子消毒及無(wú)菌苗培養(yǎng) 選取籽粒飽滿種子，簡(jiǎn)單沖洗1 min，轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，每管約為100粒種子，70%酒精中浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次；然后在0.5%NaClO中消毒5 min，再用無(wú)菌水沖洗7～8次。接種于無(wú)激素的1/2 MS培養(yǎng)基，封口膜密封，（25±2）℃暗培養(yǎng) 2 d，再于（25±2）℃、光強(qiáng)150 μmol/（m2·s）及16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo) 選取5 d苗齡的健康幼苗，分別切取下胚軸（下胚軸切成0.5 cm左右的小段）和子葉（子葉沿靠近子葉柄的部位橫切，去距葉柄葉面積的1/3，余2/3面積的子葉），作為愈傷誘導(dǎo)的外植體，分別接種于不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。供試培養(yǎng)基及激素配比為：MS＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；SH＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；MS＋2 mg/L 2，4-D ＋1 mg/L BAP＋4 mg/L NAA[11-12]。每 90 mm（直徑）×15 mm（高）的培養(yǎng)皿接種20塊，每種外植體、每個(gè)激素水平設(shè)置80～100塊，16 h/8 h光周期培養(yǎng)，溫度（25±2）℃、光強(qiáng)150 μmol/（m2·s）。每隔2周繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)基同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)4周后，觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀況，并統(tǒng)計(jì)出愈數(shù)，計(jì)算出愈率。

1.3.3 愈傷組織分化 下胚軸經(jīng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，按愈傷組織的不同來(lái)源，各取60～80塊，分別接入MS和SH（均添加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）芽分化培養(yǎng)基，每100 mm（直徑）×40 mm（高）的培養(yǎng)皿接種10塊，16 h/8 h光周期培養(yǎng)，（25±2）℃、光強(qiáng)150 μmol/（m2·s）。每2周繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)基同芽分化培養(yǎng)基。誘導(dǎo)8周后，統(tǒng)計(jì)再生芽的愈傷組織數(shù)，計(jì)算分化率。

1.3.4 根的誘導(dǎo) 不同來(lái)源的愈傷組織在芽分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)30～50 d后可生成芽，待無(wú)根小苗長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，從基部切下，移入1/2 MS或1/2 MS＋1 mg/L IBA生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)，每100 mm（直徑）×40 mm（高）的培養(yǎng)皿接種10個(gè)，培養(yǎng)條件同芽分化，觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.3.5 擴(kuò)繁及移栽 再生苗的擴(kuò)繁培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基相同，切取抗性苗頂芽或帶1個(gè)腋芽的莖段接入擴(kuò)繁培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同芽分化。觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況。當(dāng)再生的小植株出現(xiàn)3條以上健壯根時(shí)，稍打開培養(yǎng)皿蓋，室內(nèi)鍛煉1～2 d后再將幼苗從培養(yǎng)皿中取出，小心用流水沖凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽于盛有花土的小花盆中，花土需經(jīng)浸水過(guò)夜。最初3～5 d，盛裝小花盆的容器可遮上塑料薄膜以保持濕度，當(dāng)小苗長(zhǎng)出健壯莖葉時(shí)，可將其移入大花盆中。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

出愈率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；分化率＝分化出芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%；生根率＝生根的植株數(shù)/接種的無(wú)根小苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)首先以新疆大葉下胚軸為材料，研究不同的基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，接種到MS培養(yǎng)基（含2 mg/L 2，4-D）上培養(yǎng)4周后，出愈率達(dá)86.5%；而接種到SH培養(yǎng)基（含2 mg/L 2，4-D）上時(shí)，愈傷組織開始發(fā)生的時(shí)間相對(duì)較遲，但最終出愈率為83.5%，與在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)之間無(wú)明顯差異。

2.2 不同基因型、外植體和激素配比對(duì)愈傷誘導(dǎo)及其生長(zhǎng)狀況的影響

從表1可以看出，在MS并附加各種激素的培養(yǎng)基上，無(wú)論對(duì)于下胚軸還是子葉外植體，2種基因型苜蓿間出愈率均沒(méi)有明顯差異；而在SH培養(yǎng)基上，新牧一號(hào)下胚軸和子葉的出愈率均高于新疆大葉，但基因型間愈傷組織的形態(tài)特征及生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯差別。

激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響較大。在MS和SH這2種培養(yǎng)基上，KT濃度為0.2 mg/L時(shí)，出愈率達(dá)到最大，下胚軸出愈率92.7%～98.5%，子葉出愈率80.4%～85.6%。在含2 mg/L 2，4-D，1.0 mg/L BAP和4.0 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，下胚軸和子葉的出愈率明顯小于在MS或SH培養(yǎng)基上附加0.2 mg/L KT時(shí)的出愈率，愈傷組織呈黃色團(tuán)塊狀，質(zhì)地堅(jiān)硬。下胚軸和子葉不同外植體在相同培養(yǎng)條件下的愈傷組織誘導(dǎo)率差異較為明顯。在各種培養(yǎng)基及激素配比下，下胚軸愈傷啟動(dòng)時(shí)間短，在第3～5天時(shí)，就開始有愈傷組織形成，而子葉最早要到第7天，而且下胚軸的出愈率明顯高于子葉。

表1 不同基因型、外植體和激素配比對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

綜合評(píng)價(jià)，MS＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT 培養(yǎng)基適用于新疆大葉下胚軸和子葉的愈傷誘導(dǎo)，SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT適用于新牧一號(hào)。

2.3 不同愈傷組織來(lái)源及培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織分化的影響

為了進(jìn)一步比較不同培養(yǎng)基、激素及基因型對(duì)下胚軸外植體再生的影響，選擇了4個(gè)試驗(yàn)組合（表2）分析其再生率。

表2 不同的培養(yǎng)基組合

從MS和SH（均附加2 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L KT）培養(yǎng)基中分別挑選不同基因型下胚軸來(lái)源的新鮮淡綠色愈傷組織，接種到MS和SH（附加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng)。在2種培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，愈傷組織表面均開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)（圖1-A），并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓呐郀铙w（圖1-B，C）。繼續(xù)培養(yǎng)4～6周后，部分愈傷組織分化出芽（圖1-D）。

從分化培養(yǎng)8周后統(tǒng)計(jì)的分化率結(jié)果（表3）可以看出，相同來(lái)源的愈傷組織在MS培養(yǎng)基上的分化率均高于SH培養(yǎng)基，表明培養(yǎng)基類型對(duì)愈傷組織的分化影響較大，添加1 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基更加適宜不定芽誘導(dǎo)。

表3 不同基因型下胚軸在不同組合條件中的再生率

2.4 生根、擴(kuò)繁及移栽情況

在愈傷組織分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30～50 d后，將長(zhǎng)至2～3 cm的再生芽從愈傷組織基部切下，轉(zhuǎn)入不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基，7～10 d即可生根，生根率達(dá)100%。選取抗性苗頂芽或帶1個(gè)腋芽的莖段接入不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)繁培養(yǎng)第2代后，生根過(guò)程明顯推遲至第15～20天，而且多為短而粗的主根，很少出現(xiàn)不定根。為此，向1/2 MS培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA，生根過(guò)程略有提前，并有不定根形成（圖1-E）。將出現(xiàn)3條以上健壯根的再生小植株經(jīng)室內(nèi)鍛煉后移入小花盆（圖1-F），成苗率達(dá)100%。

2.5 不同培養(yǎng)基及激素組合下植株的比較

由表3還可知，對(duì)于新疆大葉而言，盡管組合Ⅰ，Ⅱ中的出愈率略高于組合Ⅲ，Ⅳ，但分化率明顯降低，并由此導(dǎo)致再生率降低，下胚軸再生率最高的為組合Ⅲ，達(dá)46.54%；而新牧一號(hào)下胚軸在組合Ⅲ，Ⅳ中的出愈率及分化率均高于組合Ⅰ，Ⅱ，所以再生率也顯著提高，其中組合Ⅲ的再生率達(dá)54.96%。

3 討論與結(jié)論

多數(shù)研究認(rèn)為，基因型對(duì)苜蓿的再生能力影響較大。馬海燕等[13]研究表明，以下胚軸為外植體，在MS＋2 mg/L 2，4-D＋2 mg/L NAA＋1 mg/L KT 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周內(nèi)，新疆大葉和新牧一號(hào)的出愈率均達(dá)92%以上，且新疆大葉略優(yōu)于新牧一號(hào)；至4周時(shí)，二者愈傷誘導(dǎo)無(wú)顯著差別，在附加15 mg/L GSH＋6 mg/L ABA的MS分化培養(yǎng)基上，新疆大葉的分化率高于新牧一號(hào)。而蘭研[14]的研究則認(rèn)為，以葉片為外植體，在同樣的培養(yǎng)基上新疆大葉出愈率較新牧一號(hào)高，但在MS＋4 mg/L KT的分化培養(yǎng)基上，新牧一號(hào)的綠點(diǎn)率及成苗率高于新疆大葉?？梢?，不能簡(jiǎn)單判斷二者再生能力的大小，所謂再生能力的強(qiáng)弱是基于其所處的培養(yǎng)條件。本試驗(yàn)中，盡管新疆大葉和新牧一號(hào)的再生能力也存在一定差異，如在SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT培養(yǎng)基上新疆大葉的出愈率略高于新牧一號(hào)，而在其他培養(yǎng)基上新牧一號(hào)則高于新疆大葉，但差異不顯著，2種基因型下胚軸來(lái)源的愈傷組織的分化能力也無(wú)明顯差異。由此可見，在本試驗(yàn)中，基因型對(duì)苜蓿的再生能力并沒(méi)有顯著影響，但需要說(shuō)明的是，這個(gè)結(jié)論的得出基于試驗(yàn)中所采用的相同的外植體、培養(yǎng)基類型及激素配比這個(gè)前提條件。

在植物離體培養(yǎng)的過(guò)程中，外植體的內(nèi)源激素水平不斷變化，在培養(yǎng)基中添加不同種類、不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)可以影響內(nèi)源激素的水平，從而影響外植體的生長(zhǎng)狀況，控制細(xì)胞脫分化和形態(tài)建成[15]。一些試驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度的細(xì)胞分裂素能夠提高愈傷組織的誘導(dǎo)率[16]。在本試驗(yàn)中，也得到了類似的結(jié)果，在愈傷組織的培養(yǎng)階段，KT能輔助2，4-D發(fā)揮更好的效果，0.2 mg/L是KT對(duì)于下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)最適宜的濃度，過(guò)高濃度的KT反而會(huì)降低愈傷組織的誘導(dǎo)率。這也與潘競(jìng)麗等[16]的研究以及王涌鑫等[17]對(duì)保定苜蓿的研究結(jié)果相一致。但肖燕等[12]以2mg/L2，4-D＋1mg/L BAP＋4 mg/L NAA的激素配比成功從新疆大葉和新牧一號(hào)下胚軸誘導(dǎo)出愈傷組織，且培養(yǎng)4周時(shí)出愈率達(dá)100%；而本試驗(yàn)中盡管通過(guò)該培養(yǎng)基也誘導(dǎo)出愈傷組織，但出愈率較低，最高出愈率僅為86.7%，愈傷組織狀況也不如附加2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT的培養(yǎng)基，這可能是由于試劑不同所造成的，具體的原因還有待進(jìn)一步分析。借鑒馬暉玲等[18]的研究，本試驗(yàn)中愈傷組織在含1.0mg/LBAP和0.3 mg/L NAA的培養(yǎng)基上也成功分化出芽，且分化率最高達(dá)到55.8%。

幾乎苜蓿所有器官或組織都可以作為外植體，但對(duì)于不同的基因型、在不同的培養(yǎng)條件下，合適的外植體選擇也是決定再生體系成功的一個(gè)關(guān)鍵因素。近年來(lái)，在紫花苜蓿再生體系建立的研究中，子葉和下胚軸是較常用的外植體[12，19-21]，且下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率高于子葉。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，無(wú)論是對(duì)于不同的基因型，還是不同的培養(yǎng)基、不同濃度的KT，下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率均明顯高于子葉，下胚軸最高出愈率達(dá)98.5%，子葉最高為85.6%，而且下胚軸愈傷啟動(dòng)時(shí)間短，愈傷質(zhì)量較好。

愈傷組織的誘導(dǎo)和分化對(duì)培養(yǎng)基的需求是不同的。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，新疆大葉在MS培養(yǎng)基上的出愈率略優(yōu)于SH培養(yǎng)基，新牧一號(hào)則相反，但是愈傷組織的分化率結(jié)果證明，來(lái)源于SH培養(yǎng)基的愈傷組織分化能力要明顯高于MS培養(yǎng)基。在愈傷組織分化階段，含相同激素的MS分化培養(yǎng)基要優(yōu)于SH培養(yǎng)基。受不同培養(yǎng)基的影響，植株的再生率也出現(xiàn)顯著差異。由此可見，對(duì)于2種苜蓿而言，SH更加適宜愈傷組織的誘導(dǎo)，而MS培養(yǎng)基更利于愈傷組織的分化。

綜上所述，適用于2種苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別為SH（附加2 mg/L 2，4-D 和 0.2 mg/L KT），MS（附加 1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）和 1/2 MS（擴(kuò)繁時(shí)附加 1 mg/L IBA）。

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