丁 慧 陳勝良 李 吉 楊 華

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1(200001)上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院檢驗科2 內(nèi)鏡室3 病理科4

胃黏膜腸化生被認為是腸型胃癌的重要癌前狀態(tài)，流行病學研究顯示胃腸化生患者的胃癌發(fā)生風險增高達10倍以上，不完全型腸化生與胃癌的關(guān)系更為密切［1］。臨床和實驗研究顯示幽門螺桿菌(Helicobactor pylori，Hp)感染和胃內(nèi)膽汁反流與胃黏膜腸化生和癌變密切相關(guān)［2，3］，但其機制尚不完全清楚。尾型同源框基因2(caudal type homeobox 2，CDX2)為尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員之一，其編碼蛋白是一種腸道特異性基因關(guān)鍵調(diào)控因子，胃黏膜腸化生和Barrett食管上皮中均可見CDX2異位表達。杯狀細胞特異性基因黏蛋白2(mucin 2，MUC2)為腸道特異性基因之一，其表達受CDX2調(diào)控。Xu等［3］分別以鵝去氧膽酸和膽汁酸核受體法尼酯X受體(FXR)激動劑作用于正常大鼠胃上皮細胞，發(fā)現(xiàn)兩者均可誘導CDX2、MUC2 mRNA和蛋白表達，且該作用可為FXR拮抗劑所阻斷，表明膽汁酸系通過FXR誘導胃黏膜腸化生和癌變。本研究以有膽汁反流的慢性胃炎患者為研究對象，分析胃液總膽汁酸(total bile acid，TBA)濃度和Hp感染情況與腸化生指標CDX2、MUC2蛋白表達的相關(guān)性，為探索膽汁酸參與胃黏膜癌變的機制提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、標本來源

收集2011年6月～2012年7月81例因上消化道癥狀于上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院接受胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)有胃內(nèi)膽汁反流［內(nèi)鏡下見胃黏液湖黃染和(或)黏膜有黃色黏液附著］且無腹部手術(shù)史者和40例無膽汁反流(胃黏液湖清)者的胃液標本(15 mL)，于胃竇部至少取2塊活檢標本。同時采集受檢者空腹靜脈血，離心分離血清，留取3 mL血清，-20℃保存。

膽汁反流組男41例，女40例，年齡21～82歲，平均(49.23±16.54)歲;對照組(無膽汁反流)男20例，女20例，年齡19～82歲，平均(53.75±13.81)歲。兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計學意義。

二、方法

1.病理診斷:胃黏膜活檢標本常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，由一名資深病理科醫(yī)師根據(jù)“中國慢性胃炎共識意見”［4］中的相關(guān)標準作出病理診斷。

腸化生分型:胃黏膜標本蠟塊4 μm連續(xù)切片，行AB-PAS、HID-AB染色，染色液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。以結(jié)腸和小腸組織作為陽性對照，以正常胃黏膜組織作為陰性對照。完全結(jié)腸型:腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見細胞異型，可見Paneth細胞，可見藍色AB(+)和黑色HID(+)染色細胞;完全小腸型:腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見細胞異型，可見Paneth細胞，可見藍色AB(+)染色細胞;不完全結(jié)腸型:腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可見細胞異型，Paneth細胞少或無，可見藍色AB(+)、紅色 PAS(+)和黑色HID(+)染色細胞;不完全小腸型:腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，可見細胞異型，Paneth細胞少或無，可見藍色AB(+)和紅色PAS(+)染色細胞。

2.胃液 TBA檢測:胃液標本3350×g離心15 min，取上清液。TBA測定試劑盒(循環(huán)酶法)為德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司產(chǎn)品，線性范圍為0.5～190 μmol/L，使用羅氏 MODULAR P800 全自動生化分析儀進行檢測。由于標本為含有膽汁的胃液，膽汁酸濃度較高，故將生化分析儀設(shè)置為超過線性范圍時自動以0.9%NaCl溶液5倍稀釋標本，以保證檢測結(jié)果的準確性。

3.血清Hp IgG抗體檢測:Hp IgG抗體檢測試劑盒(間接固相免疫層析法)為新加坡MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd產(chǎn)品，按試劑盒說明進行操作。

4.CDX2、MUC2免疫組化染色:胃黏膜標本蠟塊4 μm連續(xù)切片，以EnVision二步法行CDX2、MUC2免疫組化染色。鼠抗人CDX2單克隆抗體、鼠抗人MUC2單克隆抗體為上海長島生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(1:50稀釋)，ChemMateTMEnVision+/HRP/DAB兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品。以PBS代替一抗作為陰性對照，以結(jié)腸或小腸組織作為陽性對照。CDX2蛋白陽性染色定位于細胞核，MUC2蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)/細胞外膜，根據(jù)陽性細胞比例和細胞染色強度進行評分，總分為兩項評分之積。陽性細胞比例:＜10%，0分;10% ～30%，1分;31% ～60%，2分;＞60%，3分。細胞染色強度:淺黃色，0分;黃色，1分;棕黃色，2分。總分≤3判為陰性(-)，≥4判為陽性(+)。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、病理診斷

膽汁反流組慢性非萎縮性胃炎(chronic nonatrophic gastritis，CNAG)37例，其中15例伴活動性，4例伴腸化生;慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)44例，均伴腸化生，其中高級別上皮內(nèi)瘤變1例，低級別上皮內(nèi)瘤變31例。對照組40例均為CNAG，未見伴活動性或腸化生者。

根據(jù)AB-PAS、HID-AB染色結(jié)果，膽汁反流組44例CAG患者中，18例(40.9%)腸化生分型為完全結(jié)腸型(見圖1)，26例(59.1%)為完全小腸型(見圖2)，未見不完全結(jié)腸型腸化生和不完全小腸型腸化生。

二、胃液TBA濃度和血清Hp IgG抗體陽性率

膽汁反流組胃液TBA濃度明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，其中CAG組顯著高于CNAG組。膽汁反流組血清Hp IgG抗體陽性率略低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義，CAG組與CNAG組間差異亦無統(tǒng)計學意義(見表1)。

表1 各組胃液TBA濃度、血清Hp IgG抗體陽性率比較

三、胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達

CDX2蛋白表達定位于細胞核，腸化生上皮中陽性細胞著色均勻、清晰(見圖3);MUC2蛋白表達定位于細胞質(zhì)，在腸化生上皮中主要分布于陽性細胞(以杯狀細胞為主)的周邊部胞質(zhì)，以核周、核膜處最為明顯，形似“戒指”，或胞質(zhì)彌漫著色呈細顆粒狀(見圖4)。膽汁反流組CDX2、MUC2蛋白陽性表達率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，其中CAG組顯著高于CNAG組(見表2)。

表2 各組胃黏膜CDX2、MUC2蛋白陽性表達率比較n(%)

四、膽汁反流組胃液TBA濃度、Hp感染情況與胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達的關(guān)系

根據(jù)胃液TBA濃度將膽汁反流組分為四個亞組:0～500、501～1000、1001～3000 和 ＞3000 μmol/L亞組，各亞組間胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，陽性表達率隨TBA濃度的逐級增高呈上升趨勢;血清Hp IgG抗體陽性與陰性組間CDX2、MUC2蛋白表達差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Hp感染陽性者陽性表達率明顯高于Hp感染陰性者。胃液 TBA＞3000 μmol/L者的CDX2、MUC2蛋白陽性表達率顯著高于Hp感染陽性者(P＜0.01)(見表3)。

表3 膽汁反流組胃液TBA濃度、Hp感染情況與胃黏膜CDX2、MUC2蛋白表達的關(guān)系n(%)

討 論

圖1 完全結(jié)腸型腸化生(HID-AB染色，×200)

圖2 完全小腸型腸化生(HID-AB染色，×200)

圖3 CDX2在腸化生細胞中的表達(免疫組化EnVision二步法，×400)

圖4 MUC2在腸化生細胞中的表達(免疫組化EnVision二步法，×400)

盡管胃黏膜癌變的機制尚未完全闡明，但現(xiàn)有研究認為胃癌，尤其是腸型胃癌的發(fā)生與Hp感染有關(guān)，Hp感染可引起慢性胃炎，經(jīng)過多個步驟的癌前病變(腸化生、異型增生)進展至胃癌［5］。除Hp感染外，胃內(nèi)膽汁反流亦可促成胃黏膜腸化生和癌變［3］。本研究中有膽汁反流的CAG組腸化生發(fā)生率為100%，而CNAG組腸化生發(fā)生率僅為10.8%，前者胃液TBA濃度顯著高于后者，證實膽汁酸在胃黏膜腸化生的形成過程中起重要作用。膽汁反流組Hp感染率略低于無膽汁反流的對照組(56.8%對65.0%)，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與膽汁反流可抑制Hp在胃黏膜中的定植有關(guān)［6］。

CDX2基因編碼的腸特異性轉(zhuǎn)錄因子參與正常腸上皮細胞的生長、分化和表型維持，正常胃黏膜上皮中檢測不到CDX2表達，一旦檢出CDX2，則意味著腸化生的發(fā)生［2］。MUC2基因產(chǎn)物是一種分泌型腸型大分子黏蛋白，廣泛表達于杯狀細胞中，胃癌及其癌前病變?nèi)缒c化生黏膜中可檢出異位表達的 MUC2［7］。Babu 等［8］研究了 Hp 感染胃癌前病變患者的胃黏膜黏蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)腸化生黏膜中胃型黏蛋白MUC5AC、MUC6表達明顯下調(diào)(＞50%)，并出現(xiàn)腸型黏蛋白MUC2表達(＞75%)，表達形式為杯狀細胞胞質(zhì)彌漫表達，表明MUC2表達可作為胃黏膜腸化生的可靠指標。本研究中有膽汁反流的CAG組腸化生發(fā)生率明顯高于CNAG組，胃黏膜CDX2、MUC2蛋白陽性表達率亦顯著高于 CNAG組，證實CDX2和MUC2可作為胃黏膜腸化生的分子標記物。

盡管目前許多研究結(jié)果支持Hp感染是引起胃黏膜腸化生的重要因素之一［2］，但 Satoh等［9］的研究卻發(fā)現(xiàn)，15例Hp感染胃腸化生患者接受Hp根除治療，其中13例Hp根除后12個月腸化生并未消退，CDX2表達亦未消失，表明Hp感染并非引起胃黏膜腸化生的惟一因素。本研究發(fā)現(xiàn)在有膽汁反流的患者中，胃黏膜CDX2、MUC2蛋白陽性表達率隨胃液TBA濃度的逐級增高呈上升趨勢，TBA＞3000 μmol/L者兩種蛋白陽性表達率均高達91.2%，明顯高于TBA濃度為0～500、501～1000和1001～3000 μmol/L者，證實高濃度膽汁酸亦為引起胃黏膜腸化生和CDX2、MUC2表達的重要因素。膽汁反流組Hp感染陽性者的CDX2、MUC2蛋白陽性表達率雖然顯著高于Hp感染陰性者(63.0%對31.4%和60.9%對37.1%)，但顯著低于TBA＞3000 μmol/L者的相應(yīng)陽性表達率，表明在有膽汁反流的患者中，高濃度膽汁酸(TBA＞3000 μmol/L)是較Hp感染更主要的致腸化生因素。

本研究采用AB-PAS、HID-AB染色對44例有膽汁反流的CAG患者進行腸化生分型，結(jié)果顯示40.9%為完全結(jié)腸型，59.1%為完全小腸型。關(guān)于腸化生分型與胃癌的關(guān)系目前仍有爭議。多數(shù)學者認為腸化生是胃癌前病變，尤其是不完全型腸化生與腸型胃癌關(guān)系密切［1］，但 Petersson 等［10］發(fā)現(xiàn)正常人群的胃黏膜腸化生檢出率高達23%，不完全型腸化生檢出率亦達4%，Conchillo等［11］發(fā)現(xiàn)盡管不完全型腸化生僅見于腸型胃癌，但其檢出率僅為26.3%，提示這一改變并非胃癌發(fā)生所必須，腸化生作為癌前病變在胃癌發(fā)生中的作用可能被高估。Cassaro等［12］認為在胃癌高危人群中，腸化生的分布范圍同樣能提示癌變風險。本研究中有膽汁反流的CAG患者無一例存在不完全型腸化生，因此從腸化生分型的角度不能說明高濃度膽汁酸有致胃黏膜癌變的可能性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明高濃度膽汁酸是Hp感染之外另一個引起胃黏膜腸化生和CDX2、MUC2表達的重要因素且其作用可能大于Hp感染，有效治療胃內(nèi)膽汁反流和Hp感染可能預防腸型胃癌的發(fā)生。由于條件限制，本研究未能采用快速尿素酶試驗等其他Hp感染檢測方法，僅以血清Hp IgG抗體陽性作為科研診斷Hp感染的標準不夠嚴謹，本研究亦未能進一步探討胃內(nèi)膽汁反流與Hp感染在誘導胃黏膜腸化生中是否具有協(xié)同作用，上述局限有待后續(xù)研究加以完善。

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