張 瑩，黃哲甦

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

復(fù)方氨基酸注射液(3AA)為復(fù)方制劑，由纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸配制而成，可用于各種原因引起的肝性腦病、重癥肝炎以及肝硬化、慢性活動性肝炎。亦可用于肝膽外科手術(shù)前后。該品種現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(二部)第六冊(生化藥品第一分冊)中，國外藥典未見收載。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定僅規(guī)定用適宜的氨基酸分析儀或高效液相色譜儀測定氨基酸的含量，因目前國內(nèi)使用氨基酸分析儀分析該品種的情況較少，多數(shù)情況下使用柱前衍生高效液相色譜法進行測定，且柱前衍生法可采用幾種不同的方法，如:PITC、DNFB、AQC等方法，不同的方法需要制備合適的對照品溶液和供試品溶液的濃度，以及采用不同的衍生試劑等。考慮到原標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的可操作性較差，對樣品質(zhì)量的仲裁帶來一定的難度，因此本文采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸注射液(3AA)的含量［1］，該方法具有準(zhǔn)確、快速和靈敏度高等優(yōu)點。

1 儀器與試劑

Agilent 1100液相色譜儀。復(fù)方氨基酸注射液(3AA)由天津天安藥業(yè)股份有限公司提供(批號201007152、200906206、201002221)。對照品纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸及正亮氨酸(批號均為1406424－200805)均購自中國藥品生物制品檢定所。無水醋酸鈉(天津市文達稀貴試劑化工廠)為分析純，異硫氰酸苯酯為化學(xué)純，乙腈為色譜純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 ml/min;柱溫:40 ℃;檢測波長:254 nm，各種氨基酸的理論板數(shù)均大于20 000，分離度均大于2.0。流動相:A為0.1 mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.5)－乙腈(93∶7);B為乙腈－水(80∶20)，梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 取正亮氨酸適量，加水溶解并稀釋制成每1 ml中約含0.8 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取纈氨酸對照品約50 mg、亮氨酸對照品約65 mg、異亮氨酸對照品約50 mg，置同一250 ml量瓶中，加水適量，60℃水浴加熱溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻;精密量取5 m l，置10 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 供試品溶液 精密量取本品2 ml，置50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 衍生和測定方法 精密量取對照品溶液和供試品溶液各2 ml，分別置具塞試管中，精密加入1 mol/L三乙胺溶液－乙腈(14∶86)1 ml，0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液1 ml，搖勻，在50℃水浴中反應(yīng)45 min，取出，放冷;再分別精密加入正己烷1 ml，搖勻，放置30 min后(溶液至澄清)，取澄清的下層液各2 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算含量，見圖1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

2.4 線性關(guān)系考查 精密稱取纈氨酸對照品約100 mg、亮氨酸對照品約130 mg、異亮氨酸對照品約100 mg，置同一250 ml量瓶中，加水適量，60℃水浴加熱溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液;分別精密量取對照品貯備液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml置10 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液2 m l進行衍生，按上述色譜條件測定峰面積，結(jié)果表明:纈氨酸在濃度為19.942 ～159.536 μg/ml范圍內(nèi)峰面積與其呈線性關(guān)系，線性方程為:Y=－28.0+7.329 X(r=0.9995);亮氨酸在濃度為 26.176 ～ 209.408 μg/ml范圍內(nèi)峰面積與其呈線性關(guān)系，線性方程為:Y= －41.52+6.877 X(r=0.9998);異亮氨酸在濃度為19.794 ～158.352 μg/ml范圍內(nèi)峰面積與其呈線性關(guān)系，線性方程為:Y= －1.70+6.797 X(r=0.9998)。

2.5 穩(wěn)定性考查 取衍生后的供試品溶液，放置0、1、2、3、4、6 和 24 h 分別進行測定，結(jié)果亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸峰面積的RSD值分別為0.56%、0.73%和0.31%。表明供試品溶液中亮氨酸、纈氨酸和異亮氨在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性考查 取同一批號(200906206)樣品6份，按照上述方法分別進行測定。結(jié)果樣品中亮氨酸平均含量為99.3%，RSD為0.87%;纈氨酸平均含量為99.1%，RSD為 0.96%;異亮氨酸平均含量為97.9%，RSD 為 0.66%。

2.7 回收率考查 分別稱取亮氨酸對照品約52、65和80 mg，纈氨酸和異亮氨酸對照品約40、50和60 mg各3份置250 ml量瓶中，加水適量，60℃水浴加熱溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻;精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，照含量測定方法進行衍生和測定，亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸平均回收率分別為:99.6%(RSD 為 0.43)、98.5%(RSD 為 0.52)和 99.2%(RSD為 0.49)。見表 2。

表2 回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品的測定 取3個批號的樣品照上述方法測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 在衍生化時曾用較低濃度的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，結(jié)果衍生物峰面積較小，而濃度過高又會產(chǎn)生其他的衍生物，因此選擇0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液為適當(dāng)?shù)臐舛冗M行衍生。

3.2 本文建立的方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，有較高的靈敏度，可用于復(fù)方氨基酸注射液(3AA)的含量測定。

1 楊昭鵬，曾文珊，楊曉暉，等.腦蛋白水解物注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Ⅱ)［J］.藥物分析雜志，2003，23(2):106