付曉昉，趙 興

(天津市第五中心醫(yī)院，天津 300450)

2型糖尿病患者除了糖代謝紊亂以外，常常合并 有其他嚴(yán)重的代謝紊亂，其中包括肥胖和脂質(zhì)代謝異常，主要表現(xiàn)為血甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)水平的升高。TG和FFA以往只被認(rèn)為是主要的必需能量物質(zhì)，然而近期研究提示TG和FFA在生理?xiàng)l件狀態(tài)下，不僅僅為多種細(xì)胞提供能量，在葡萄糖刺激的胰島素分泌中也起著重要的作用。但細(xì)胞水平的研究顯示長(zhǎng)期高TG和FFA非但不能增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌，反而使其受損［1，2］。提示脂代謝紊亂不僅構(gòu)成胰島素抵抗的組分，也是引起β細(xì)胞功能紊亂的因素之一。長(zhǎng)期的游離脂肪酸血癥對(duì)胰島β細(xì)胞的影響卻十分復(fù)雜。基于此，本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DM大鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周后，觀察血脂及胰島β細(xì)胞功能的變化。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào) SCXK(京)2009－0004］，6～8周齡，體重180～200 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生系毒理學(xué)教研室，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)水、進(jìn)食，飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。室內(nèi)通風(fēng)良好，每日12 h光照交替，相對(duì)濕度40% ～70%，室溫18～22℃。

1.2 藥品及試劑 鏈脲佐菌素(美國Sugma公司);枸櫞酸、枸櫞酸鈉(天津市化學(xué)試劑一廠);血甘油三酯測(cè)定試劑盒(浙江東甌生物工程有限公司);血糖測(cè)定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司);血游離脂肪酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);胰島素放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.3 儀器設(shè)備 TN－100B型托盤扭力天平(上海第二天平儀器廠);半自動(dòng)生化分析儀(荷蘭 Vital Scientific公司);GC－1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器(南昌新長(zhǎng)征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司);D8982－33型水純化系統(tǒng)(美國Bamstead公司);恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠);液氮罐、37℃水浴箱、37℃恒溫箱、加樣器、離心管、立式電熱壓力蒸汽滅菌器。

1.4 方法

1.4.1 STZ誘導(dǎo)的DM大鼠模型的建立與分組 造模前夜，24只大鼠自由進(jìn)食、水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日稱重后，將大鼠置于鼠盒中，酒精棉球擦拭大鼠尾部使靜脈暴露，按35 mg/kg的劑量尾靜脈注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.4)建立糖尿病大鼠模型。注射7 d后，尾取血測(cè)基礎(chǔ)血糖≥7.0 mmol/L，糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為DM大鼠。DM大鼠隨機(jī)分為糖尿病正常飲食組(B組8只)和糖尿病高脂飲食組(C組8只)。隨機(jī)選擇8只正常大鼠為正常對(duì)照組(A組)。A組和B組給予正常飲食(總熱量14 kJ/g，脂肪9%)，C組給予高脂飲食(總熱量20 kJ/g，脂肪占45%)。

1.4.2 標(biāo)本的收集與處理 12周后大鼠禁食過夜12 h，動(dòng)物以3%戊巴比妥鈉 (80 mg/kg)腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血分離血清待測(cè)，留取胰尾組織，留有部分脾臟以定位，液氮保存。

1.4.3 血TG和FFA測(cè)定 血甘油三酯(TG)采用GPO－PAP乙酰丙酮法，血糖用葡萄糖糖化酶法，血游離脂肪酸(FFA)采用銅顯色法測(cè)定。

1.4.4 胰島內(nèi)胰島素的抽提和測(cè)定 參照Zhou and Grill等［3］酸乙醇法提取胰島內(nèi)的胰島素，放射免疫方法測(cè)定胰島素含量。

1.4.5 口服葡萄糖耐量試驗(yàn) 大鼠處死前3 h，50%葡萄糖按照2 g/kg體重灌胃，分別于葡萄糖負(fù)荷前0 min，負(fù)荷后60、120 min尾靜脈取血，分離血清，即日以葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖濃度。其余血清－20℃保存，一周內(nèi)放射免疫分析技術(shù)測(cè)定0 min血胰島素濃度(批內(nèi)變異系數(shù)CV＜10%)。以修正的β細(xì)胞胰島素分泌指數(shù)［MBCI:(INS×BG)/(2 hPG+1 hPG －7.0)］［4］評(píng)估 β 細(xì)胞功能。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)值以±s表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血FBG、TG和FFA比較 與A組相比，B和C組FBG明顯升高(均為P＜0.01)，且后兩組之間亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與A組相比，B和C組血TG(均P ＜0.01)和 FFA(均 P ＜0.01)均明顯增高，且C組增高更明顯(與B組相比，TG和FFA均 P ＜0.01)。見表1。

2.2 胰島內(nèi)胰島素含量比較 B組和C組胰島素含量明顯低于A組(均P＜0.01)，C組胰島素含量較B組進(jìn)一步降低，為B組的47.1%(P＜0.01)。見表2。

表1 各組大鼠血糖、血脂比較(±s)

表1 各組大鼠血糖、血脂比較(±s)

與 A組相比，*P ＜0.01;與 B 組相比，▽ P ＜0.05，▽▽ P ＜0.01

組別 只數(shù) FBG(mmol/L)TG(mmol/L)FFA(μmol/L)A 8 4.9 ±0.6 0.34 ±0.06 197.25 ±0.07 B 8 17.5 ±2.9* 0.45 ±0.06* 286.90 ±56.32*C 8 24.2 ±5.0*▽ 1.13 ±0.20*▽▽ 569.81 ±69.55*▽▽

表2 各組胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素含量比較(±s)

表2 各組胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素含量比較(±s)

與 A組相比，*P ＜0.01;與 B 組相比，▽ P ＜0.01

分組 只數(shù) 細(xì)胞內(nèi)胰島素含量(μIU/g)A 402.47 ±30.88 B 8 259.37 ±36.45*8 C 8122.36 ±21.48*▽

2.3 各組大鼠MBCI的比較 B組和C組MBCI顯著低于A組，分別為A組的76.5%(P＜0.05)和39.3%(P＜0.01);而 C組的MBCI較B組進(jìn)一步下降了37.7%(P ＜0.01)。見表3。

表3 各組大鼠MBCI比較(±s)

表3 各組大鼠MBCI比較(±s)

與 A 組相比，*P ＜0.05，＊＊ P＜0.01;與B 組相比，▽P ＜0.01

分組 只數(shù)MBCI A 23.9 ±5.2 B 8 18.3 ±4.2*8 C 811.4 ±1.7＊＊▽

3 討論

研究表明脂代謝紊亂不僅僅是DM的一個(gè)并發(fā)癥，對(duì)疾病發(fā)生和發(fā)展也起著重要的作用。血脂升高對(duì)糖尿病患者產(chǎn)生多種危害，如影響胰島β細(xì)胞分泌功能，加重胰島素抵抗，促進(jìn)心腦血管并發(fā)癥和糖尿病腎病等的發(fā)生和發(fā)展。長(zhǎng)期的游離脂肪酸血癥對(duì)胰島β細(xì)胞的影響十分復(fù)雜。胰島β細(xì)胞長(zhǎng)期在游離脂肪酸的環(huán)境中，其原有的葡萄糖刺激的分泌胰島素功能就會(huì)下降，胰島素原的合成減少，胰島素的儲(chǔ)備也降低［5］。本實(shí)驗(yàn)采用小劑量STZ尾靜脈注射的方法制成DM大鼠模型，觀察給予長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響。

在細(xì)胞內(nèi)FFA和葡萄糖的代謝是相互影響的，有研究顯示，F(xiàn)FA的代謝方式主要取決于葡萄糖濃度。生理狀態(tài)下，F(xiàn)FA通過β氧化途徑供能;但在高糖環(huán)境下，F(xiàn)FA則優(yōu)先進(jìn)入非氧化代謝途徑，合成大量的TG和二酯酰甘油(DAG)等，導(dǎo)致β細(xì)胞過多的脂質(zhì)沉積，可能影響β細(xì)胞胰島素分泌。本實(shí)驗(yàn)觀察到，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血TG和FFA水平增高，而高脂飲食組的糖尿病大鼠TG和FFA進(jìn)一步升高。在糖尿病組大鼠血TG和FFA水平增高的同時(shí)，β細(xì)胞分泌功能受損，而以高脂飲食喂養(yǎng)的糖尿病大鼠表現(xiàn)更為顯著。血TG和FFA水平升高損傷胰島素分泌功能的機(jī)制可能在于兩者促進(jìn)TG在β細(xì)胞沉積所致，即脂毒性。有研究顯示，在胰島素分泌嚴(yán)重受損的糖尿病大鼠的β細(xì)胞內(nèi)，TG水平升高可達(dá)50～100倍，當(dāng)糖尿病的癥狀逆轉(zhuǎn)后，胰島細(xì)胞內(nèi)TG的積聚減少。FFA促進(jìn)胰島細(xì)胞內(nèi)軟脂酸的酯化作用，增加3－磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)的活性和的mRNA的表達(dá)［6］。亦有研究顯示在高糖環(huán)境下，使CPT－1活性受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致脂酰－CoA在細(xì)胞漿中大量的蓄積［7］。FFA和TG在β細(xì)胞內(nèi)的堆積超過了組織的利用能力，進(jìn)而產(chǎn)生毒性作用，影響胰島素的表達(dá)［8，9］。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到糖尿病高脂飲食組的胰島內(nèi)胰島素含量較正常組明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)此觀點(diǎn)。β細(xì)胞過多的FFA除影響胰島素分泌外，亦能促進(jìn)其凋亡［10］，另外還可合成大量的神經(jīng)酰胺，后者亦可引起β 細(xì)胞功能障礙［11］。

本研究通過長(zhǎng)期高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的DM大鼠，觀察到TG和FFA與胰島內(nèi)胰島素含量與β細(xì)胞功能的關(guān)系。長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)的糖尿病大鼠在血TG和FFA升高的同時(shí)，β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量減少，分泌功能顯著下降。此結(jié)果提示在臨床上降低TG和FFA含量可能有益于β細(xì)胞分泌功能的恢復(fù)。

1 Chen N G，Reaven G M.Fatty acid inhibition of glucose stimulated insulin secretion is enhanced in pancreatic islets from insulin resistant rats［J］.Metabolism，1999，48(10):1317

2 Kelpe C L，Johnson L M，Poitout V.Increasing triglyceride synthesis inhibits glucose－induced insulin secretion in isolated rat islets of langerhans:a study using adenoviral expression of diacylglycerol acyltransferase［J］.Endocrinology，2002，143(9):3326

3 Kathrin Maedler，Jose Oberholzer，Pascal Bucher，et al.Monounsaturated fatty acids prevent the deleterious effects of palmitate and high glucose on human pancreaticβ － Cell turnover and function［J］.Diabetes，2003，52(3):726

4 李光偉，楊文英，姜亞云，等.以(FINS FPG)/(PG2h+PG1h－2FPG)評(píng)估胰島β細(xì)胞分泌功能的可行性探討［J］.中華內(nèi)科雜志，2000，39(4):234

5 J D McGarry，R L Dobbins.Fatty acid，lipotoxicity and insulin secret ion［J］.Diabetologia，1999，42(2):128

6 Lee Y，Hirose H，Zhou Y T，et al.Increased lipogenic capacity of the islets of obese rats:a role in the pathogenesis of NIDDM［J］.Diabetes，1997，46(3):408

7 Roduit R，Morin J，Masse F，et al.Glucose down － regulates the expression of the peroxisome proliferator－activeted receptor－αgene in the pancreatic β － cell［J］.J Biol Chem，2000，275(46):35799

8 S Jacqueminet，I Briaud，C Rouault，et al.Inhibition of insulin gene expression by long－term exposure of pancreaticβcell to palmitate is dependent on the presence of a stimulatory glucose concentration［J］.Metabolism，2000，49(4):532

9 Harmon J S，Gleason C E，Tanaka Y，et al.In vivo prevention of hyperglycemia also prevents glucotoxic effects on PDX－1 and insulin gene expression［J］.Diabetes，1999，48(10):1995

10 Liang H，Zhong Y，Zhou S，et al.Palmitic acid－induced apoptosis in pancreatic β－cells is increased by liver X receptor agonist and attenuated by eicosapentaenoate［J］.In Vivo，2011，25(5):711

11 Lang F，Ullrich S，Gulbins E，Ceramide formation as a target in betacell survival and function［J］.Expert Opin Ther Targets，2011，15(9):1061