楊靜芳， 陳 凌， 張新勝， 卞琳琳， 吉訓(xùn)明

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京市老年病醫(yī)療研究中心科研處，北京 100053)

0 引言

標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量的樣本庫是重大疾病基礎(chǔ)與臨床研究、臨床診治技術(shù)研發(fā)、藥物研發(fā)、健康研究與產(chǎn)業(yè)化，即實現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的最寶貴資源。隨著生物醫(yī)藥研究的飛速發(fā)展，臨床樣本資源的重要性已經(jīng)得到廣泛的重視和充分的認識。臨床樣本是不可再生的寶貴資源，高質(zhì)量的臨床研究樣本對探索新的治療方法、發(fā)現(xiàn)新的診斷工具、制定新的診斷指標(biāo)以及新藥的研發(fā)都凸顯出極其重要的意義。醫(yī)學(xué)臨床樣本的收集管理和利用日益引起發(fā)達國家醫(yī)學(xué)研究工作者的重視，國外早已建立了標(biāo)準(zhǔn)化的樣本庫且信息化管理機制不斷完善。目前，國際知名的樣本庫有聯(lián)合了幾大歐洲重點生物庫的泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心(BBMRIhttp://www.bbmri.eu)，英國生物樣本庫(UK Biobank，http://www.ukbiobank.ac.uk)及法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院 (INSERM，http://www.english.inserm.fr)等。

中國有龐大的臨床樣本資源，且有能力將其妥善處理并加以保存。建設(shè)高質(zhì)量、高標(biāo)準(zhǔn)的樣本庫將給我國的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供強有力的支撐[1]。然而，目前我國綜合醫(yī)院臨床樣本庫建設(shè)尚處于初創(chuàng)階段，由于缺乏足夠的交流與溝通，不同的樣本庫在建設(shè)過程中沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，在管理和質(zhì)量水平上存在角度的差別，同國外的樣本庫也存在著一定的差距[2]。近期，通過實地調(diào)研及國際交流等方式，就綜合醫(yī)院臨床樣本庫的建立與管理做了一些相應(yīng)的考察、研究和分析。

1 資料與方法

(1)文獻復(fù)習(xí)。通過清華同方中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、中國科技論文統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫(CSTP)及萬方數(shù)據(jù)庫，以“樣本庫”為關(guān)鍵詞，檢索2006～2011年相關(guān)中文文獻。共獲得文獻81篇，選取其中與醫(yī)學(xué)衛(wèi)生或生物科學(xué)相關(guān)且有代表性的22篇文獻進行學(xué)習(xí)，對樣本庫的建設(shè)和管理有了理論認識。

(2)實地調(diào)研。2011年6月赴上海對第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院國家肝癌樣本庫[3-4]進行實地調(diào)研，并與樣本庫管理人員、工作人員及樣本管理系統(tǒng)的軟件開發(fā)人員(上海生物信息技術(shù)研究中心)進行面對面交流，學(xué)習(xí)建庫的成功經(jīng)驗。該樣本庫啟動于2008年，依托于國家科技重大專項課題建立了專業(yè)性的肝癌樣本庫，利用雙重條形碼技術(shù)結(jié)合樣本信息化管理系統(tǒng)實現(xiàn)了臨床組織樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化管理[5-7]，是臨床組織樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)試點單位之一。

(3)國際交流。2010年10月參加2010第二屆中國組織生物樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)與應(yīng)用研討會，于2011年7月參加國際標(biāo)準(zhǔn)化生物樣本庫的管理與質(zhì)控會議暨2011年上海生物樣本庫建設(shè)研討會，于2012年6月參加第四屆中國生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建立與應(yīng)用研討會，于2013年3月參加《ISBER最佳實踐2012》培訓(xùn)，于2013年4月參加《生物樣本庫質(zhì)量管理實戰(zhàn)培訓(xùn)》[8-11]。目前，有關(guān)生物樣本庫的國際交流平臺主要集中在上海，歷次會議匯集了泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心(BBMRI)、英國生物樣本庫(UK Biobank)、法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院(INSERM)等國際著名的生物樣本庫建設(shè)主體單位負責(zé)人及國內(nèi)知名樣本庫的負責(zé)人。會議期間，通過與國內(nèi)外專家學(xué)者進行面對面的交流討論，深刻領(lǐng)悟了樣本庫建設(shè)的重大意義及標(biāo)準(zhǔn)化管理的迫切性。

(4)政策法規(guī)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)學(xué)習(xí)。通過互聯(lián)網(wǎng)檢索國際及國內(nèi)有關(guān)遺傳資源及樣本庫建設(shè)方面的政策法規(guī)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)等文件。學(xué)習(xí)并了解了國際上的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一般遵循ISO 9001認證或OECD(Organization for Economic Co-operation and Development)指南。而我國目前沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對樣本庫的資質(zhì)也沒有統(tǒng)一的國家認證。我國臨床樣本庫的現(xiàn)狀是，依托于研究項目或課題的資金資助，建立適用于各自項目的技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)體系。所謂“標(biāo)準(zhǔn)化”實際上很難統(tǒng)一，短時間內(nèi)很難建立國家的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。由于人類遺傳資源的特殊性質(zhì)，涉及倫理學(xué)問題，因此，國際上遵循HUGO倫理委員會章程，而我國于1998年出臺的《人類遺傳資源管理暫行辦法》(國辦發(fā)[1998]36號)則為遺傳資源的保護、開發(fā)利用及倫理學(xué)方面提供了法律依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本庫的建立

(1)基礎(chǔ)設(shè)施與儀器設(shè)備。要求具有獨立空間，設(shè)置專門的庫房，面積根據(jù)樣本庫庫存量而定，但基本的區(qū)域應(yīng)該具備:標(biāo)本出入庫登記區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、臨床資源數(shù)據(jù)庫區(qū)、冷凍區(qū)(劃分－80℃超低溫冰箱、－150℃液氮罐兩個溫度冷凍區(qū))、標(biāo)本分析區(qū)等(見圖1)。另外，樣本庫必須具備專用電源及備用電源、空調(diào)及實時監(jiān)控設(shè)施。

圖1 樣本庫架構(gòu)

(2)實施方案與技術(shù)路線。臨床樣本庫建立的基本路線是收集、保存、利用，其基本原則是臨床醫(yī)生提出需求，針對某種疾病的樣本進行有目的收集，而不是任何臨床樣本都要收集。① 臨床醫(yī)生一定要參與樣本收集，與患者或家屬簽署知情同意書，并對臨床信息進行采集，以保證標(biāo)本的相關(guān)資料收集保存完整。②樣本庫的工作人員需具有責(zé)任心及相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)知識，樣本收集的關(guān)鍵在于樣本的質(zhì)量，操作過程應(yīng)避免外界污染以及標(biāo)本之間的交叉污染，嚴(yán)格控制標(biāo)本離體時間，從而確保標(biāo)本的質(zhì)量，樣本的收集一定按照嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP，見圖2)，每個崗位由專人負責(zé)，并進行崗前培訓(xùn)。③樣本庫建立目的是為了利用，只有充分利用樣本庫的資源達到物盡其用，才能避免“垃圾進，垃圾出”的后果。最后，樣本庫的成敗在于規(guī)范化管理，只有按照一定標(biāo)準(zhǔn)進行收集、保存及利用，才能真正發(fā)揮樣本庫的作用，為臨床研究服務(wù)?？傊?，臨床樣本庫的建立和正常運行需要醫(yī)院各部門(臨床科室、手術(shù)室、病理科、設(shè)備科)協(xié)調(diào)配合，尤其需要醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的大力支持，并得到本單位倫理委員會的批準(zhǔn)。

圖2 樣本采集標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

2.2 標(biāo)本的質(zhì)量控制

(1)組織標(biāo)本的收集、處理及保存。取材部位必須準(zhǔn)確，一定要由病理科醫(yī)生進行取材，在腫瘤組織離體30 min內(nèi)，在保證醫(yī)院病理科留取足夠用于診斷的組織標(biāo)本后，按癌、癌旁(距離腫瘤組織2 cm的組織)和切緣遠端非癌組織(正常組織)，分別切成數(shù)小塊，根據(jù)應(yīng)用范圍做下述3種處理:①用于RNA提取的組織:將組織標(biāo)本切成厚度小于0.5 cm的小塊，投入到5倍體積的RNAlater試劑中，4℃浸泡過夜，第2 d從RNAlater中取出標(biāo)本，放于凍存管中，－80℃保存。②用于DNA及蛋白提取的組織:切取小塊標(biāo)本不經(jīng)處理，直接放入凍存管中，置于液氮處理30 min，再轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱保存。③用于石蠟包埋的組織:標(biāo)本取材后立即置10%中性甲醛水溶液固定過夜，流水沖洗約3 h，然后放入自動脫水機脫水、透明、浸蠟，再用石蠟包埋，制成蠟塊。所有的石蠟包埋組織均進一步切片，HE染色，鑒定組織形態(tài)。蠟塊和切片分別歸檔保存，HE染色切片在顯微鏡下照相存于電腦數(shù)據(jù)庫中。

(2)血液標(biāo)本的收集、處理及保存。采集患者血液標(biāo)本10 mL，抗凝血和非抗凝血各5 mL，做如下處理:①非抗凝血采集后室溫靜置2～3 h，以3 000 rpm離心5 min，吸出上層血清，分裝到10支凍存管內(nèi)，每管約200 μL，凍存于－80℃超低溫冰箱。②抗凝血以3 000 r/min離心5 min，吸出上層血漿，分裝到凍存管中，凍存于－80℃保存。③分離血漿后的下層血液，用生理鹽水反復(fù)洗滌并離心分離白細胞后，用鹽析法提取基因組DNA，分裝凍存管中，－80℃保存。

(3)標(biāo)本信息資料的記錄。主要包括以下內(nèi)容:病人的一般資料(姓名、性別、年齡、民族、職業(yè)、聯(lián)系方式、住院號、病例摘要、臨床診斷、病理診斷、實驗室檢查、其他檢查等);標(biāo)本資料(入庫編號、入庫時間、病變部位、標(biāo)本描述、標(biāo)本類型、標(biāo)本數(shù)量、庫存位置等);標(biāo)本使用資料(出庫編號、出庫時間、出庫數(shù)量、標(biāo)本類型、實驗內(nèi)容、實驗結(jié)果、使用人、使用日期、審批人等);標(biāo)本廢除資料(廢除序號、廢除原因、入庫編號、標(biāo)本原庫存位置、廢除日期、經(jīng)手人等)。

(4)標(biāo)本的定期隨機抽樣質(zhì)控。對庫存標(biāo)本定期隨機抽樣進行總RNA提取鑒定，對RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計分析，若得出A260/A280﹥1.6，1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見明顯的28 s和18 s條帶，而且28 s的亮度大約是18 s的1～2倍，表明RNA保存比較完整。

2.3 標(biāo)本庫的規(guī)范化管理

(1)數(shù)據(jù)庫管理。在臨床樣本庫中，有大量資料需要記錄，包括患者信息、臨床資料、病理資料、標(biāo)本信息和隨訪信息等。建立一套組織科學(xué)合理、信息全面而專業(yè)化的標(biāo)本庫管理系統(tǒng)，對各類標(biāo)本信息進行完善的組織和管理，是創(chuàng)建標(biāo)本庫的前提條件[12]。標(biāo)本管理系統(tǒng)可以根據(jù)本單位情況自行開發(fā)設(shè)計，也可以請專業(yè)的軟件開發(fā)公司個性化定制。目前，很多公司開發(fā)了針對大型臨床樣本庫而設(shè)計的標(biāo)本管理軟件系統(tǒng)，系統(tǒng)運行平臺一般基于Windows XP操作系統(tǒng)?？紤]到數(shù)據(jù)庫的安全及運行速度，最好配有獨立的服務(wù)器，以保證數(shù)據(jù)庫的高安全性和高容量。隨著醫(yī)學(xué)信息系統(tǒng)的日益普及和完善，作為物流跟蹤過程中的關(guān)鍵技術(shù)“條形碼技術(shù)”已在臨床醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院建立的國家肝癌樣本庫采用雙重條形碼定位技術(shù)，同一個樣本具有兩個條形碼標(biāo)簽，一個是樣本編碼，另一個是定位編碼，其編碼規(guī)則一目了然，即使由于疏忽導(dǎo)致樣本放錯位置，也可以根據(jù)定位編碼很容易找到其相應(yīng)位置。目前，最新出現(xiàn)的二維碼技術(shù)[13]解決了樣本信息容量的問題，但是編碼不直觀，只能通過計算機掃描識別。另外，樣本庫信息管理系統(tǒng)需具備與醫(yī)院HIS系統(tǒng)接口，以便提取患者的基本信息和檢驗、治療、病理及隨訪等信息。

(2)標(biāo)本庫管理。建立統(tǒng)一的管理規(guī)范，明確工作環(huán)節(jié)中的規(guī)章制度，從入庫到出庫都必須有章可循。標(biāo)本庫的工作人員編制相對固定，需具備一定的技術(shù)水平和實驗室管理能力，明確標(biāo)本庫工作人員職責(zé)，實現(xiàn)專人負責(zé)，加強對各崗位工作人員專業(yè)知識培訓(xùn)，并增強對標(biāo)本庫維護的責(zé)任感，保證標(biāo)本從收集、保存到利用整個過程有條不紊進行。目前，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會頒布了生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)[14]，規(guī)范了我國生物樣本庫的管理。

3 討論

隨著人類基因組計劃的完成，為重大疾病諸如腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病、老年病、精神疾病及遺傳病等相關(guān)基因的功能研究提供了基本藍圖。利用人類基因組工作所取得的成果，研究和了解與生理和疾病相關(guān)的基因或遺傳因素的前提就是要有疾病相關(guān)的遺傳資源，包括遺傳物質(zhì)如DNA、病變組織及臨床流行病學(xué)資料等。因此，遺傳資源已成為21世紀(jì)重大疾病研究中最具有依賴性的因素。

目前，生命科學(xué)界清楚地認識到，世界范圍內(nèi)的遺傳資源(生物樣本庫)網(wǎng)絡(luò)的創(chuàng)立和協(xié)作將成為重建現(xiàn)代生物基因組和后基因組至關(guān)重要的一步。我國也將重大疾病遺傳資源收集和保存、利用列入“十五”重大科技專項“人類重大疾病相關(guān)基因的研究”項目的子課題[15]。但是目前，這些重大疾病遺傳資源的收集、保存和利用工作還存在許多問題:① 樣本收集隨機性且無代表性;②缺乏多學(xué)科研究人員的協(xié)作;③缺乏嚴(yán)格的程序規(guī)范及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn);④遺傳資源的利用率低下;⑤倫理學(xué)立法有待完善。

4 結(jié)語

生物樣本庫已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和藥品研發(fā)領(lǐng)域新的必備基礎(chǔ)和來源，它所承載的歷史使命極具挑戰(zhàn)性。①建立和維護一個大型的生物樣本庫，不僅僅是一項簡單的收集工作，而是要通過樣本庫將現(xiàn)有的寶貴的遺傳資源轉(zhuǎn)化成基因?qū)W研究的新工具，從而賦予其特定的知識價值，促進醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展。②樣本庫既不可能快速建立，也不容易維護，更是難以在短時間內(nèi)成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥研發(fā)中的一個完整有效的組成部分。樣本庫涉及各種復(fù)雜和交叉的知識體系網(wǎng)絡(luò)，其發(fā)展取決于眾多因素。最后，樣本庫創(chuàng)造價值的能力，取決于管理體系的建立和有序模式的建立。為了是一個樣本庫能夠正常運轉(zhuǎn)，必須要建立一系列樣本研究的科學(xué)有效性的質(zhì)量管理機制。

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[3] 國家肝癌樣本庫數(shù)據(jù)平臺[EB/OL].http://nltb.org/.

[4] 我校東方肝膽外科醫(yī)院國家肝癌樣本庫及共享數(shù)據(jù)庫取得階段性成果[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，31:6.

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[10] 《ISBER 最佳實踐2012》[EB/OL].http://www.biobank.org.cn/inf_InfoDtlByPicLst.aspx?InfoID=384

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[15] 劉 斌.衛(wèi)生部科教司關(guān)于發(fā)布重大疾病遺傳資源的收集、保存與利用課題申報指南的通知[EB/OL].http://www.biotech.org.cn/swj/new.