河北省滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（000）李勝水 李雙標(biāo) 張鳳梅

河北省滄州市人民醫(yī)院（061001）李秀清3

河北省滄州市青縣人民醫(yī)院（062650）李翠萍4 李麗5

原發(fā)性肝癌是肝臟中最常見的惡性腫瘤，其病理類型90%以上是肝細(xì)胞癌[1]（hepatocellular carcinoma，HCC）。ILK是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有3個(gè)結(jié)構(gòu)單位的Ser/Thr蛋白激酶，作為整合素和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要效應(yīng)物，ILK調(diào)節(jié)著細(xì)胞的粘著、生存、分化和凋亡[2]。其相關(guān)蛋白PKB、GSK3等是細(xì)胞程序死亡和細(xì)胞周期循環(huán)的重要調(diào)節(jié)蛋白。由于這些原因，使得ILK與腫瘤的形成、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）也稱血管通透因子（VPF）[3]，具有很強(qiáng)的血管生成和增強(qiáng)血管通透性的作用，在腫瘤血管生成中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)的強(qiáng)弱直接影響著腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[4][5][6]。

本研究通過檢測(cè)ILK和VEGF在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，分析表達(dá)結(jié)果與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系及兩者的相關(guān)性，并為肝細(xì)胞癌的靶向治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1一般資料 收集滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2004年1月～2013年6月手術(shù)切除標(biāo)本55例及距腫物至少4cm處正常肝組織20例，且均未在手術(shù)前行放、化療。所有切片均由具有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理科主任醫(yī)師進(jìn)行復(fù)檢。每例選取蠟塊4μm連續(xù)切片1～2張，進(jìn)行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。

1.2實(shí)驗(yàn)材料和方法 鼠抗人ILK、VEGF單克隆抗體，DAB顯色試劑盒，S-P試劑盒及其他試劑均為福州麥新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后4μm連續(xù)切片，采用S-P法常規(guī)免疫組化染色，以中性磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對(duì)照，以已知ILK、VEGF陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌組織做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) ILK、VEGF陽(yáng)性結(jié)果的判定均以胞質(zhì)呈棕黃色至棕褐色顆粒狀，而細(xì)胞核處空泡狀或染色淡為準(zhǔn)。每張切片采用隨機(jī)10個(gè)高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比計(jì)算陽(yáng)性百分率。ILK陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率＜10%定為（-），11～30%定為（+），31～75%定為（++），76～100%定為（+++）；VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率＜6%定為（-），7～25%定為（+），26～75%定為（++），76～100%定為（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)ILK、VEGF的表達(dá)情況與肝細(xì)胞癌病理分級(jí)的關(guān)系以及各指標(biāo)之間的相互關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

ILK、VEGF在正常肝組織、肝細(xì)胞癌病理分級(jí)以及兩指標(biāo)之間的相互關(guān)系見附表1和2。

附表1 ILK、VEGF在正常肝組織、肝細(xì)胞癌病理分級(jí)以及兩指標(biāo)之間的相互關(guān)系

在55例肝細(xì)胞癌中，ILK49例表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率89.1%，陽(yáng)性染色主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)；在20例正常對(duì)照的有4例表達(dá)弱陽(yáng)性（+），其余為陰性，陽(yáng)性率20%，陽(yáng)性染色主要位于正常肝細(xì)胞。肝細(xì)胞癌中ILK陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常肝細(xì)胞組（P＜0.05）。中低分化組陽(yáng)性率93.8%和100%高于高分化組50%（P＜0.05）；且低分化組15例樣本中陽(yáng)性表達(dá)（++）11例、（+++）3例，明顯高于高分化組8例樣本中陽(yáng)性表達(dá)（++）1例、（+++）0例。VEGF有53例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率96.4%，陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞胞質(zhì)，在20例正常對(duì)照的有1例表達(dá)陽(yáng)性（++），4例弱陽(yáng)性（+），其余為陰性，陽(yáng)性率25%，陽(yáng)性染色主要位于間質(zhì)細(xì)胞及部分肝細(xì)胞。肝細(xì)胞癌中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常肝細(xì)胞組（P＜0.05）。中低分化組陽(yáng)性率96.4%高于高分化組75%（P＜0.05），且低分化組15例樣本中陽(yáng)性表達(dá)（++）10例、（+++）4例，高于高分化組8例樣本中陽(yáng)性表達(dá)（++）4例、（+++）0例。55例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中二者共同陽(yáng)性49例，二者共同陰性2例，ILK、VEGF的表達(dá)具有明顯相關(guān)性（P＜0.05）。

附表2 肝細(xì)胞癌中ILK、VEGF指標(biāo)之間的關(guān)系

3 討論

實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)很大程度上依賴于持續(xù)的血管生成，血管的生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起著非常重要的作用。VEGF與受體結(jié)合后通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，增加微血管的通透性，促進(jìn)血漿蛋白外漏，基底膜降解，最終導(dǎo)致新的基質(zhì)及新的血管形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供條件。本研究顯示，VEGF在肝細(xì)胞癌組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常肝細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率（P＜0.05）；同時(shí)中低分化肝細(xì)胞癌中VEGF含量明顯高于高分化肝細(xì)胞癌，表明隨著腫瘤細(xì)胞分級(jí)的增高，VEGF含量表達(dá)增強(qiáng)，提示VEGF定量檢測(cè)可作為肝細(xì)胞癌一種早期無(wú)創(chuàng)性診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的良好指標(biāo)。

整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一種新近發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶。它能通過與整合素β1和β3亞單位的結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接。目前研究證據(jù)顯示，ILK的過度表達(dá)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。ILK在人類前列腺癌、肺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、肝癌等組織中均高表達(dá)，且表達(dá)程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果相吻合。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將ILK過表達(dá)的細(xì)胞導(dǎo)入裸鼠體內(nèi)可引發(fā)腫瘤[7][8][9][10][11]。本研究顯示：在肝細(xì)胞癌組織中ILK的陽(yáng)性表達(dá)率89.1%。肝細(xì)胞癌組織中ILK呈棕黃色顆粒，定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)。ILK 蛋白在肝細(xì)胞癌組的表達(dá)率89.1%明顯高于正常肝細(xì)胞組陽(yáng)性率20%，且表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；同時(shí)中低分化組陽(yáng)性率93.8%和100%高于高分化組50%（P＜0.05）；且低分化組15例樣本中陽(yáng)性表達(dá)（++）11例、（+++）3例，明顯高于高分化組8例樣本中陽(yáng)性表達(dá)（++）1例、（+++）0例，提示ILK對(duì)于促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)性。

本研究結(jié)果表明，VEGF與ILK的表達(dá)有明顯的相關(guān)性，隨著ILK表達(dá)的升高，VEGF表達(dá)也升高，ILK與VEGF存在正相關(guān)，且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明它們之間有著某種必然的聯(lián)系，提示ILK與VEGF在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能存在協(xié)同作用。

綜上所述，ILK與VEGF參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程，二者的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的分化程度密切相關(guān)，成為評(píng)估肝細(xì)胞癌惡性程度的重要生物學(xué)指標(biāo)。