解燕春 關(guān)景霞 周 琴 梁靜靜 曾艷平

成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)側(cè)腦室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）存在神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）［1］。近年來(lái)研究證實(shí)［2］，腦出血能激活內(nèi)源性NSCs增殖，并遷移至血腫周?chē)瑥亩龠M(jìn)腦出血后的神經(jīng)修復(fù)。亞低溫能否促進(jìn)腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)再生尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察腦出血在亞低溫干預(yù)后同側(cè)SVZ及血腫周?chē)鶱SCs，探討其對(duì)腦出血后內(nèi)源性NSCs的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作及分組

健康雄性清潔級(jí)SD大鼠48只，體重（200±20）g。SD大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上，頭皮正中切開(kāi)，剪開(kāi)骨膜，暴露前囟，于顱骨背側(cè)前囟后0.2 mm，中線(xiàn)旁3mm處鉆一直徑為2 mm的孔。用固定于立體定位儀上30號(hào)無(wú)菌針頭沿針孔垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度為5.8 mm（此為尾狀核的位置），注射溶有膠原酶0.4IU的生理鹽水2μl。隨機(jī)分為對(duì)照組和亞低溫組，每組又分為7、14、21、28 d四個(gè)亞組，每亞組6只大鼠。對(duì)照組肛溫保持在（37±0.5）℃，亞低溫組術(shù)后立即開(kāi)始誘導(dǎo)亞低溫，且持續(xù)24 h。

1.2 亞低溫處理

亞低溫組予以冰袋加全身噴灑稀釋乙醇降溫，用電子溫度計(jì) （歐姆龍大連有限公司）監(jiān)測(cè)深部肛溫（插入深度≥5 cm），每30 min測(cè)量一次肛溫，溫度控制在（34±1）℃，當(dāng)肛溫低于33℃時(shí)，用60 W白熾燈照射大鼠軀干部升溫，24 h后撤去冰塊及白熾燈，使體溫自然恢復(fù)正常。

1.3 NSCs的標(biāo)記

腦出血模型制作后腹腔注射細(xì)胞增殖特異性標(biāo)記物BrdU（10 mg／ml溶于生理鹽水，50 mg·kg－1·次－1）標(biāo)記處于增殖狀態(tài)的 NSCs，2次／d，直至在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。

1.4 BrdU免疫組織化學(xué)染色

各組動(dòng)物在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)心臟進(jìn)行灌注，斷頭取腦，以注入針道為中心，冠狀切下組織塊，厚約4 mm，剩余部分棄去。組織塊放入4% 多聚甲醛內(nèi)，后固定4 h，換入20%蔗糖溶液中過(guò)夜至組織塊沉底。標(biāo)本用恒溫冰凍切片機(jī)經(jīng)血腫中心作連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，將切片置于50%甲酰胺2×SSC溶液中65℃溫水浴2 h，再置于2N HCl溶液中37℃溫水浴30 min進(jìn)行DNA變性，再用0.1 mol／L硼酸漂洗10 min后以3%H2O2覆蓋30 min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；然后進(jìn)行親和素－生物素法染色，一抗為小鼠抗大鼠BrdU，二抗為生物素化的馬抗小鼠抗體，DAB顯色后，進(jìn)行水洗、脫水、透明、封片。

1.5 圖像及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用HPIAS圖像分析系統(tǒng)對(duì)同側(cè)SVZ及血腫周?chē)M(jìn)行圖像分析，每張切片對(duì)應(yīng)部位隨機(jī)抽取8個(gè)不重復(fù)的高倍視野，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)用±s表示。BrdU染色以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性。各組數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行組間t比較，顯著性水平α＝0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)差異具有顯著性意義。

2 結(jié) 果

免疫組化方法標(biāo)記的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，形態(tài)多樣，呈圓形、橢圓形或梭形。正常腦細(xì)胞染成藍(lán)色。結(jié)果顯示腦出血后對(duì)照組大鼠同側(cè)SVZ和血腫周?chē)鶥rdU陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)在7 d時(shí)開(kāi)始增加，14 d達(dá)到高峰，21 d后開(kāi)始下降，直至28 d仍有表達(dá)。亞低溫組大鼠7 d，14 d，21 d及28 d同側(cè)SVZ和血腫周?chē)鶥rdU陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加，且增加的時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），說(shuō)明腦出血后亞低溫干預(yù)可以促進(jìn)SVZ的NSCs增殖，并向血腫周?chē)w移（圖1、2）。

圖1 腦出血后同側(cè)SVZ的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞

圖2 腦出血后血腫周?chē)腂rdU陽(yáng)性細(xì)胞

3 討 論

腦出血是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的腦卒中亞型，其死亡率和致殘率高。目前，腦出血的治療，如機(jī)械清除血腫、藥物預(yù)防腦水腫及降低顱內(nèi)壓，對(duì)腦出血患者功能恢復(fù)的作用非常有限。如何更好地促進(jìn)腦出血患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，提高其生活質(zhì)量，是目前迫切需要解決的問(wèn)題。

成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)NSCs存在于SVZ和SGZ。在生理?xiàng)l件下內(nèi)源性NSCs可活化增殖，SVZ增殖的NSCs經(jīng)吻側(cè)遷移流（rostral migratory stream，RMS）遷移到嗅球并分化為GABA能顆粒細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元，參與嗅神經(jīng)的再生；而SGZ增殖的NSCs則遷移至顆粒細(xì)胞層后分化為顆粒細(xì)胞，參與海馬神經(jīng)元的再生。NSCs的發(fā)現(xiàn)為各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來(lái)新的希望。在各種病理狀態(tài)下，如缺血性卒中及腦外傷等可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生，在一定程度上改善神經(jīng)功能。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)膠原酶誘導(dǎo)的腦出血可促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖，新生的神經(jīng)元能遷移到血腫周?chē)?，這為腦出血后神經(jīng)修復(fù)提供新的思路。本研究主要探討亞低溫能否促進(jìn)腦出血后NSCs的增殖及遷移。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類(lèi)似物，在細(xì)胞有絲分裂的S期，整合入新合成DNA。因此，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞可被看作是處于增殖狀態(tài)的NSCs。本研究結(jié)果顯示腦出血后對(duì)照組大鼠同側(cè)SVZ和血腫周?chē)鶥rdU陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)在7 d時(shí)開(kāi)始增加，14 d達(dá)到高峰，21 d后開(kāi)始下降，直至28 d仍有表達(dá)。亞低溫組大鼠各時(shí)間點(diǎn)SVZ和血腫周?chē)鶥rdU陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加，且增加的時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明腦出血后亞低溫干預(yù)可以促進(jìn)SVZ的NSCs增殖，并向血腫周?chē)w移。

研究發(fā)現(xiàn)成體腦組織中神經(jīng)再生和血管新生緊密相連［3］。新生的血管分泌許多可溶性因子可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化［4］。而且新生的血管是神經(jīng)干細(xì)胞遷移的“腳手架”［5］，指引它遷移到病灶周?chē)?。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新生血管表達(dá)血管生成素1（Angiopoietin，Ang1），相鄰的 NSCs表達(dá)其受體Tie-2。給予Ang1可促進(jìn)NSCs向病灶周?chē)w移，而拮抗Tie-2則可抑制NSCs向病灶周?chē)w移［6］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腦出血能上調(diào)Ang1及其受體Tie－2的表達(dá)［7］。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)凝血酶原能激活腦出血后大鼠血管新生［8］。Lei等研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1可通過(guò)促進(jìn)腦出血后血管新生，從而促進(jìn)其神經(jīng)再生及神經(jīng)功能恢復(fù)［9］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)亞低溫能促進(jìn)腦梗死后血管新生［10］。因此，本研究推測(cè)亞低溫可能通過(guò)促進(jìn)腦出血后血管新生從而促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖、遷移，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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