蔣 宇

福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

丹參酚酸B是中藥丹參 (Savia miltiorrhiza)中分離提取的一種酚性芳香酸類化合物［1］。多用于活血化瘀，理氣止痛，用于胸憋悶，心絞痛［2］。研究表明丹參酚酸B可保護損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，促進梗死區(qū)冠脈側(cè)支循環(huán)的形成［3］。內(nèi)皮祖細(xì)胞 (endothelial progenitor cell，EPC)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，前期研究表明其在內(nèi)皮損傷后的修復(fù)及梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)形成中起重要作用［4，5］。為進一步研究丹參酚酸B治療冠心病的作用機制，本文采用體外分離、培養(yǎng)外周血EPC，觀察丹參酚酸B對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、粘附和遷移功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人纖維連接蛋白 (fibronectin，F(xiàn)N)和血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)購自于Chemicon公司;acLDL－DiI購自 Molecular Probe公司;M199和FITC－UEA－I為Sigma產(chǎn)品;Transwell小室購自Corning公司;丹參酚酸B購自中國藥品生物制品檢定所(化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品)，其余試劑均購自上海生工公司。

1.2 EPC的分離、培養(yǎng)與鑒定 參照文獻，采用密度梯度離心的方法獲得外周血單個核細(xì)胞，在體外進行誘導(dǎo)、分化和擴增，在培養(yǎng)第7天用免疫熒光 (DiI－acLDL/FITCUEA－Ⅰ)鑒定是否是EPCs［6］。在倒置顯微鏡下觀察，剛從外周血分離獲得的單個核細(xì)胞呈圓形，在培養(yǎng)7天后，洗去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的細(xì)胞呈梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。熒光倒置顯微鏡鑒定經(jīng)UEA－Ⅰ和Di－LDL單克隆抗體標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞，UEA－Ⅰ染色陽性細(xì)胞呈綠色，Di－LDL染色陽性細(xì)胞呈紅色，UEA－Ⅰ和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞，即內(nèi)皮祖細(xì)胞，呈橙色［6－8］。

1.3 實驗方法

1.3.1 EPC增殖能力檢測 貼壁細(xì)胞隨機分為6組。對照組:M199條件培養(yǎng)液，藥物組分別設(shè) 0.2、0.4、0.8、1.6、8mg·L－1的丹參酚酸B的條件培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24、48及72h。收集處于對數(shù)生長期的EPC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至 2.0×104/ml，將細(xì)胞種至 96孔板中，每孔180μl，約3600個細(xì)胞/孔。將96孔板置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后加入不同濃度的丹參酚酸B藥物20μl/孔，對照組中加入等體積 DMEM。繼續(xù)在37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24h。24h后每孔加入40μlMTS/PMS溶液，使得 MTS、PMS終濃度分別為 333μg/ml和25μM。置37℃、5%CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。以對照組細(xì)胞生長率為100%，計算各給藥組細(xì)胞生長率=OD給藥/OD對照×100%。

1.3.2 EPC粘附能力和遷移能力檢測 收集貼壁細(xì)胞，等量接種在包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)30min后計數(shù)。將培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，將含EPC的培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，顯微鏡下計數(shù)遷移細(xì)胞［9］。

2 結(jié)果

2.1 丹參酚酸B對外周血EPC增殖影響的濃度和時效關(guān)系0.2、0.4、0.8、1.6mg·L－1丹參酚酸 B 可明顯促進EPC增殖 (P＜0.05)，呈濃度依賴性，0.8mg·L－1作用達到高峰 (P＜0.01)，丹參酚酸B作用24h后EPC開始明顯增加，72h時達到最大效應(yīng) (P＜0.05)，呈時間依賴性。8mg·L－1丹參酚酸B對外周血EPC增殖有抑制作用 (Tab 1)。

Tab 1 MTS assay of human EPCs inresponse to Salvianolic acid B(±s，n=60)

Tab 1 MTS assay of human EPCs inresponse to Salvianolic acid B(±s，n=60)

Concentration of dansehnsu/mg·L－1 490nm light absorbance 24h 48h 72h 0.2 0.193 ±0.033 0.236 ±0.046 0.287 ±0.058 0.4 0.229 ±0.052 0.279 ±0.056 0.325 ±0.036 0.8 0.241 ±0.041 0.29 ±0.045 0.332 ±0.054 1.6 0.23 ±0.062 0.273 ±0.022 0.312 ±0.032

2.2 丹參酚酸B對外周血EPC功能的影響 不同濃度丹參酚酸B作用24h后，可改善EPC的遷移和粘附能力，作用呈濃度依賴性，0.8mg·L－1丹參酚酸B達最大效應(yīng)，8mg·L－1時對EPC數(shù)量和功能有抑制作用 (Tab1)。空白對照組，0.2、0.4、0.8、1.6mg·L－1丹參酚酸B的粘附細(xì)胞數(shù)(×103)分別為:0.25±0.09、0.5±0.07、1.5±0.13、1.88±0.54、1.48±0.04和0.19±0.07，遷移細(xì)胞數(shù)分別為13±5、19±4、20±7、23±8、18±5和9±3。與對照組比較，0.4、0.8、1.6mg·L－1丹參酚酸B實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0105)。

3 討論

當(dāng)前丹參酚酸B在冠心病的治療方面的作用已經(jīng)得到了大家的公認(rèn)，但對于丹參酚酸B如何保護冠心病導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷、促進冠脈側(cè)支循環(huán)建立等的機制還有待進一步研究［4，9，10］。EPC 來源于骨髓，是尚未表達成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的前體細(xì)胞在外周能定向增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。在冠脈側(cè)支循環(huán)建立的過程中，EPC能促使血管新生，促進冠脈側(cè)支循環(huán)的形成，進而縮小梗死范圍，改善因冠心病導(dǎo)致的心功能下降［11－13］。前期的研究表明冠心病患者外周血EPC數(shù)量明顯下降，其遷移能力受到損傷，如能促進EPC的遷移可以促進冠心病的恢復(fù)，干細(xì)胞因子、粒系集落刺激因子等一些外源性動員劑可動員骨髓EPC進入外周血循環(huán)，改善EPC的功能，促進血管新生。但因上述藥物均有不同程度副作用而限制了其應(yīng)用［14，15］。

本文研究結(jié)果表明丹參酚酸B能提高EPC的增殖、遷移和粘附能力，說明丹參酚酸B不僅可直接保護受損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，還可以同時增加EPC的數(shù)量并提高其功能。這一結(jié)果說明了丹參酚酸B可以促進內(nèi)皮修復(fù)和冠脈側(cè)支循環(huán)形成，進而改善冠心病患者的臨床癥狀和預(yù)后［9，16］，并且丹參酚酸B無明顯的毒副作用。因而針對其促進EPC增殖和調(diào)節(jié)EPC的分化的功能將其開發(fā)為臨床藥物具有有很好的臨床應(yīng)用前景。

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