張麗華

福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

大蒜素 (Allicin)是從蔥科蔥屬植物大蒜 (Allium Sativum)的鱗莖 (大蒜頭)中提取的一種有機(jī)硫化合物，也存在于洋蔥和其他蔥科植物中。學(xué)名二烯丙基硫代亞磺酸酯。研究證實(shí)，大蒜素具有良好的抗菌［1］、抗高血壓［2－4］等心腦血管疾病功效。近年來，越來越多的報(bào)道顯示大蒜素也具有抗腫瘤［5－6］的效果，并逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本研究采用經(jīng)典H22、S180荷瘤小鼠模型考察大蒜素注射液的抗腫瘤效果及對(duì)免疫器官的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，雄性，共228只，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證:SCXK(滬)2007－0005。

1.2 細(xì)胞株 S180小鼠肉瘤細(xì)胞株，H22人肝癌細(xì)胞株，由南京中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥學(xué)系藥理毒理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 藥品及試劑 大蒜素注射液:國(guó)藥準(zhǔn)字H20065758，廣東羅浮山國(guó)藥制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為每1ml注射液含0.105mg提取物，實(shí)驗(yàn)時(shí)用5%注射用葡萄糖稀釋至所需倍數(shù)，4℃儲(chǔ)存，現(xiàn)配現(xiàn)用。5﹪注射用葡萄糖:產(chǎn)品批號(hào):2011082607，南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司。陽性藥物:順鉑凍干粉，10mg/瓶，齊魯制藥有限公司，批號(hào)9090212DB。0.9﹪生理鹽水:產(chǎn)品批號(hào):2011091108，南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)器材 手術(shù)器械，超凈臺(tái) (蘇凈集團(tuán)安泰公司型號(hào):SW－CJ－ZFD)，電子分析天平 (德國(guó)Sartorius公司型號(hào):BT323S)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 取液氮灌凍存的S180肉瘤細(xì)胞株及H22肝癌細(xì)胞株，于37℃溫水中解凍，離心棄去凍存液，PBS洗滌后，用0.9%生理鹽水稀釋2倍，腹腔注射接種于2只小鼠體內(nèi)，接種體積為2ml。7天后，小鼠腹部出現(xiàn)明顯積水。超凈臺(tái)上，無菌操作下抽取腹水，加入0.9﹪生理鹽水稀釋3倍，用1ml一次性注射器吸取混勻后的細(xì)胞懸液，接種到下一代小鼠體內(nèi)，連續(xù)傳代4次，最后一代傳代小鼠4只以滿足造實(shí)體瘤模型所需的細(xì)胞懸液體積，一般傳代4次使癌細(xì)胞充分活化。

2.2 腫瘤接種造模 將接種S180細(xì)胞、H22細(xì)胞后7d生長(zhǎng)良好的小鼠脫頸椎處死，固定于蠟板上，腹部皮膚經(jīng)75%酒精消毒后，用空針穿過腹部肌肉，抽吸濃稠腹水，放入無菌試管內(nèi)，注意觀察腹水顏色，腹水為乳白色無絮狀沉淀物者為佳，血性腹水則不可用。另取少量腹水觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后將腹水用無菌生理鹽水調(diào)濃度為2×106個(gè)/ml，接種于84只小鼠，每鼠右腋皮下注射0.2ml。

2.3 分組與給藥 S180及H22荷瘤實(shí)驗(yàn)小鼠腋下接種腫瘤后，次日稱重，按體重隨機(jī)分組，每組12只。此次實(shí)驗(yàn)共分成7組，依次為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、LU10注射液不 同 劑 量 組 7.5μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、60μg/kg、120μg/kg。模型對(duì)照組腹腔注射給予5﹪葡萄糖，陽性對(duì)照組腹腔注射給予順鉑2mg/kg，給藥組按上述劑量腹腔注射給藥，給藥體積均為0.1ml/10g。各組連續(xù)給藥7天，陽性藥物順鉑由于強(qiáng)烈的腎毒性，于給藥后第4天停藥一次。

實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)密觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食、毛發(fā)、糞便、小便等一般狀況。每天稱重。

于給藥7天后小鼠脫頸處死，稱重。剝?nèi)×鲶w，并取出小鼠肝臟、脾臟以及胸腺，稱重，分別計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)，并進(jìn)行比較。瘤重抑制率%=(1－T/C) ×100%。臟器系數(shù)=臟器重量/凈體重μ100。

3 結(jié)果

3.1 大蒜素注射液對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠瘤重抑制率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大蒜素注射液各劑量組均有一定的抑瘤作用，120μg/kg劑量組瘤重與模型組有差異，其他劑量組與模型組比較抑瘤作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽性藥順鉑抑瘤作用與模型組比較具有顯著性差異，見表1。

表1 大蒜素注射液對(duì)H22荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較 (±s)

表1 大蒜素注射液對(duì)H22荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較 (±s)

與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。實(shí)驗(yàn)過程中大蒜素注射液30μg/kg、60μg/kg組各死亡一只。

組別 n 劑量(μg/kg) 瘤重 (g) 抑瘤率 (﹪)52.4 12 － 0.718±0.486 －順鉑組 12 2000 0.063±0.020＊＊ 91.3大蒜素注射液 12 7.5 0.625±0.232 23.5大蒜素注射液 12 15 0.467±0.267 31.5大蒜素注射液 11 30 0.454±0.201 39.4大蒜素注射液 11 60 0.437±0.240 40.4大蒜素注射液 12 120 0.383±0.202*模型組

3.2 大蒜素注射液對(duì)H22荷瘤小鼠臟器系數(shù)的影響 結(jié)果顯示受試藥物大蒜素注射液8mg/kg劑量組能夠顯著降低肝臟、胸腺指數(shù)，16mg/kg劑量組能夠降低脾臟指數(shù)，顯著降低小鼠的肝、胸腺指數(shù)，陽性藥順鉑也顯著降低各臟器指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)過程中給藥組有不同程度的動(dòng)物死亡。

表2 大蒜素注射液對(duì)H22荷瘤小鼠的臟器指數(shù)比較統(tǒng)計(jì) (±s)

表2 大蒜素注射液對(duì)H22荷瘤小鼠的臟器指數(shù)比較統(tǒng)計(jì) (±s)

與模型組相比，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

0.04順鉑組 12 2 5.49士0.77＊＊ 0.39士0.10＊＊ 0.05士0.04＊＊大蒜素注射液 12 1 8.15士0.87 0.83士0.14 0.19士0.03大蒜素注射液 11 2 8.09士0.94 0.82士0.15 0.18士0.04大蒜素注射液 11 4 7.82士0.80 0.71士0.11 0.18士0.02大蒜素注射液 10 8 6.71士1.44＊＊ 0.81士0.15 0.11士0.05＊＊大蒜素注射液 7 16 5.746士1.56＊＊ 0.58士0.16* 0.10士0.03劑量 肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)模型組 12 8.16士0.86 0.80士0.18 0.20士組別 n＊＊

3.3 大蒜素注射液對(duì)S180荷瘤小鼠瘤重抑制率的影響見表3。從結(jié)果可以看出，大蒜素注射液對(duì)S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制成劑量依賴性，其中最高劑量有顯著性差異。陽性藥物順鉑具有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)過程中給藥組有不同程度的動(dòng)物死亡。

3.4 大蒜素注射液對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠臟器系數(shù)的影響結(jié)果顯示，陽性藥順鉑會(huì)降低荷瘤小鼠的臟器系數(shù)大蒜素注射液對(duì)小鼠肝、脾和胸腺系數(shù)沒有明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)過程中給藥組有不同程度的動(dòng)物死亡。

表3 大蒜素注射液對(duì)S180各組小鼠瘤重及抑瘤率比較 (±s)

表3 大蒜素注射液對(duì)S180各組小鼠瘤重及抑瘤率比較 (±s)

組別 n 劑量(μg/kg) 瘤重 (g) 抑瘤率 (﹪)11 － 0.739±0.345 －順鉑組 12 2000 0.079±0.018＊＊ 89.3大蒜素注射液 12 7.5 0.543±0.211 26.5大蒜素注射液 12 15 0.521±0.158 29.4大蒜素注射液 11 30 0.502±0.222 32.1大蒜素注射液 11 60 0.465±0.231 37.1大蒜素注射液 12 120 0.404±0.232*模型組45.3

表4 大蒜素注射液液對(duì)S180荷瘤小鼠的臟器指數(shù)比較統(tǒng)計(jì) (±s)

表4 大蒜素注射液液對(duì)S180荷瘤小鼠的臟器指數(shù)比較統(tǒng)計(jì) (±s)

與模型組相比，＊＊P＜0.01。

11 － 5.54±0.32 0.58±0.15 0.10±0.02順鉑 12 2 4.96±0.48＊＊ 0.36±0.12＊＊ 0.06±0.04＊＊大蒜素注射液 12 7.5 5.85±0.69 0.51±0.10 0.09±0.01大蒜素注射液 12 15 5.88±0.84 0.70±0.29 0.09±0.02大蒜素注射液 11 30 5.44±0.23 0.63±0.16 0.10±0.09大蒜素注射液 11 60 5.76±0.34 0.67±0.28 0.09±0.08大蒜素注射液肝臟系數(shù) 脾臟系數(shù) 胸腺系數(shù)模型組組別 動(dòng)物數(shù) (只) 劑量 (mg/kg)12 120 5.59±0.20 0.71±0.24 0.10±0.04

5 討論

本實(shí)驗(yàn)通過建立S180和H22移植性荷瘤小鼠模型來觀察大蒜素注射液的抑瘤效果，可移植性腫瘤動(dòng)物模型是目前國(guó)內(nèi)外腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中最常用的一種模型，移植性腫瘤作為“篩選系統(tǒng)”，已證明是有效的［7］。在移植性腫瘤模型上得到的結(jié)果，經(jīng)常作為對(duì)藥物進(jìn)行臨床驗(yàn)證的基礎(chǔ)。動(dòng)物效應(yīng)模型可以提供受試物的器官特異性、劑量效應(yīng)關(guān)系資料、潛在的長(zhǎng)期動(dòng)物毒性和其他重要的藥理學(xué)資料［8］。因此，選擇合適的移植性腫瘤動(dòng)物模型進(jìn)行研究，是考察一種藥物是否有效的最為簡(jiǎn)便直接的途徑。本實(shí)驗(yàn)采用的是實(shí)體瘤動(dòng)物模型，這種移植性腫瘤模型接種成活率近100%，對(duì)宿主的影響類似，個(gè)體差異較小，可在同一時(shí)間內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)相對(duì)均勻的腫瘤，給藥時(shí)間相對(duì)固定，動(dòng)物一般狀態(tài)變化情況及腫瘤生長(zhǎng)情況可直接觀察，可在同種或同品系動(dòng)物中連續(xù)移植，長(zhǎng)期保留供試驗(yàn)用。

大蒜素注射液對(duì)S180荷瘤小鼠移植瘤抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，大蒜素注射液120μg/kg劑量組抑制腫瘤有顯著性差異 (P＜0.05)，順鉑組抑瘤率抑制腫瘤有顯著性差異 (P＜0.01)。

本實(shí)驗(yàn)在觀察大蒜素注射液抑瘤效果的同時(shí)也關(guān)注了其對(duì)荷瘤小鼠的臟器的影響，以此來推測(cè)其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。免疫系統(tǒng)以網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)形式發(fā)揮作用，免疫細(xì)胞、組織及器官的局部損害，必然會(huì)引發(fā)其它系統(tǒng)功能紊亂。因而免疫器官的臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)。脾臟和胸腺是機(jī)體較為重要的淋巴器官，是各類免疫細(xì)胞居住的場(chǎng)所，含有大量的淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，也是對(duì)抗原產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)的重要基地［9］。本實(shí)驗(yàn)顯示，陽性藥順鉑組的臟器指數(shù)均比模型組低，且有非常顯著的差異 (P＜0.01)，且從體重也顯示順鉑對(duì)于荷瘤小鼠有較大的毒副作用，有研究表明3.0～4.0mg/kgb.w的順鉑可引起小鼠出現(xiàn)明顯的聽力、腎和肝組織的損傷［10］。而大蒜素注射液對(duì)于荷瘤小鼠的臟器指數(shù)沒有顯著的影響，說明大蒜素在發(fā)揮抑瘤效果的同時(shí)對(duì)免疫系統(tǒng)沒有顯著的影響。

綜合本實(shí)驗(yàn)，說明大蒜素作為一個(gè)新的抗癌藥物在抗腫瘤的療效有一定的優(yōu)勢(shì)，因此得對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步包括抗腫瘤機(jī)制方面的深入的探究。

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