羅云敬，朱西平，安學(xué)靜，王 珺

（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124）

黃酮類(lèi)化合物具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等功能[1，2］，因此，研究天然產(chǎn)物中黃酮類(lèi)化合物的生物與化學(xué)特性十分重要。蕓香科植物柚子產(chǎn)量高，其果皮中除含有芳香油、果膠和色素外，還含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)[3－5］。柚皮中黃酮類(lèi)化合物可分為蘆丁（蕓香苷）、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷[3，6］4種，其中，新橙皮苷與橙皮苷的二苯基色原酮部分結(jié)構(gòu)相同。

目前的研究主要集中在柚皮黃酮類(lèi)化合物的提取工藝和其中單一成分的性質(zhì)方面，針對(duì)柚皮黃酮清除自由基的作用研究還較少，對(duì)其中的關(guān)鍵作用成分還不明確。

鑒于此，作者采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定酪氨酸硝化產(chǎn)物3－硝基酪氨酸（3－NT）的有效含量，評(píng)價(jià)蘆丁、柚皮苷、橙皮苷3種柚皮黃酮在抑制過(guò)氧亞硝酸根硝化損傷酪氨酸（Tyr）方面的作用，并測(cè)定3種柚皮黃酮對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基）的清除效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 3－硝基酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確配制1mg·mL－1的3－硝基酪氨酸溶液，用0.05mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2 過(guò)氧亞硝酸根溶液的制備

取100mL堿性 H2O2溶液（pH 值為12.5～13.0）與等摩爾量的亞硝酸異戊酯，在0～4℃（冰水混合物）反應(yīng)9h左右；用MnO2清除剩余H2O2溶液，所得溶液和1mol·L－1NaOH溶液于－20℃混合，即得27mmol·L－1過(guò)氧亞硝酸根溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 柚皮黃酮類(lèi)化合物對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用測(cè)試

將過(guò)氧亞硝酸根溶液分步稀釋、加入到含4mmol·L－1的酪氨酸、不同濃度柚皮黃酮（蘆丁、柚皮苷、橙皮苷）的磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7）中，最終體積為3 mL，37℃恒溫水浴60min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定3－硝基酪氨酸在365nm處的吸光度[7］。

1.4 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)

取0.5mL 9mmol·L－1FeSO4、0.5mL 9mmol·L－1水楊酸－乙醇、1mL不同濃度的柚皮黃酮，混合均勻后，加入1mL 9.8mmol·L－1H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，最終體積為3mL，37℃水浴加熱60min，在510 nm下測(cè)定吸光度，以抗壞血酸（Vc）作陽(yáng)性對(duì)照。按式（1）計(jì)算羥基自由基清除率[8］：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入柚皮黃酮溶液后的吸光度；Ax0為不加顯色劑 H2O2時(shí)的吸光度。

1.5 鄰苯三酚自氧化率測(cè)定

將2.8mL Tris－HCl緩沖溶液、0.1mL超純水混勻置于試管中，另取0.1mL酸性鄰苯三酚置于另－試管中放置；25℃預(yù)熱后，立即將兩試管溶液在比色皿中混勻并用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的吸光度隨時(shí)間的變化。檢測(cè)時(shí)間為3min。平行測(cè)定3次，取平均值。

1.6 清除超氧陰離子自由基實(shí)驗(yàn)

樣品體系（最終濃度）：50mmol·L－1緩沖溶液（pH 值7.8）、80mmol·L－1酸性鄰苯三酚、不同濃度的柚皮黃酮溶液。以超純水代替柚皮黃酮作為對(duì)照體系。以抗壞血酸（VC）作陽(yáng)性對(duì)照。按式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率[9］：

式中：△A0為鄰苯三酚自氧化的速率；△A1為清除超氧陰離子自由基后鄰苯三酚自氧化的速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 清除羥基自由基的效果（表1 ）

由表1 可看出，當(dāng)柚皮苷的濃度為0.4μg·mL－1時(shí)，清除率為46.8%；當(dāng)柚皮苷濃度達(dá)到1.0μg·mL－1時(shí)，清除率高達(dá)81.6%，幾乎是0.4μg·mL－1時(shí)的2倍。橙皮苷在2.0μg·mL－1時(shí)的清除率幾乎是0.6μg·mL－1時(shí)的4倍。蘆丁在10μg·mL－1時(shí)的清除率為88.4%，是2μg·mL－1時(shí)的16倍。蘆丁的作用濃度要高于柚皮苷和橙皮苷，蘆丁在濃度2μg·mL－1時(shí)的清除率只有5.5%，而該濃度下橙皮苷的清除率達(dá)到68.5%，柚皮苷更是在1.0μg·mL－1時(shí)清除率就高達(dá)81.6%。

文獻(xiàn)報(bào)道的清除羥基自由基的天然產(chǎn)物的濃度基本是在 mg·mL－1水平[10，11］，而本實(shí)驗(yàn)柚皮黃酮在μg·mL－1水平就已經(jīng)表現(xiàn)出非常好的清除作用。

由表1 還可看出，3種黃酮類(lèi)化合物在μg·mL－1水平清除羥基自由基的效果非常理想，且清除率均表現(xiàn)出良好的濃度依賴(lài)關(guān)系，清除50%羥基自由基所需要的化合物濃度（IC50）分別為：蘆丁8.0μg·mL－1、柚皮苷0.8μg·mL－1、橙皮苷1.0μg·mL－1，清除作用大小依次為：柚皮苷＞橙皮苷＞蘆丁，柚皮苷清除羥基自由基的作用最強(qiáng)，是蘆丁的10倍、橙皮苷的1.25倍。

表1 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷清除羥基自由基的效果Tal.1 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing·OH

2.2 對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用（表2 ）

表2 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用Tab.2 Effects of rutin，naringin，hesperidin on inhibiting the nitration of tyrosine by peroxynitrite

由表2 可看出，當(dāng)蘆丁、橙皮苷濃度為10μg·mL－1時(shí)，3－硝基酪氨酸的濃度分別為0.412mg·mL－1、0.407mg·mL－1，與對(duì)照相近；當(dāng)柚皮苷的濃度從2μg·mL－1增加到10μg·mL－1時(shí)，3－硝基酪氨酸的濃度從0.409mg·mL－1降至0.380mg·mL－1。表明，柚皮苷對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化具有抑制作用，且該抑制作用具有濃度依賴(lài)性，而蘆丁和橙皮苷沒(méi)有明顯的抑制硝化的作用。

2.3 清除超氧陰離子自由基的效果（表3 ）

表3 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷清除超氧陰離子自由基的效果Tab.3 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing

表3 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷清除超氧陰離子自由基的效果Tab.3 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing

樣品 濃度／μg·mL－1 清除率／%蘆丁16 17.24柚皮苷 16 13.79橙皮苷16 10.35

由表3 可看出，當(dāng)蘆丁、柚皮苷、橙皮苷濃度為16 μg·mL－1時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為17.24%、13.79%和10.35%。表明，柚皮黃酮在μg·mL－1水平顯示出清除超氧陰離子自由基的作用，作用大小依次為：蘆?。捐制ぼ眨境绕ぼ?。

2.4 討論

本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)較為全面的評(píng)價(jià)或篩選天然產(chǎn)物抑制或清除ONOO－、和·OH等自由基的方法。ONOO－能再分解生成和·OH，從而導(dǎo)致硝化損傷，而·OH會(huì)導(dǎo)致氧化損傷。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH[10］，3種柚皮黃酮對(duì)·OH 均在μg·mL－1水平表現(xiàn)出濃度依賴(lài)的清除作用?？梢杂珊蚇O·結(jié)合而生成，清除對(duì)于抑制ONOO－的硝化作用也具有非常重要的意義。

3 結(jié)論

以抑制過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸生成3－硝基酪氨酸評(píng)價(jià)了柚皮黃酮的抗硝化作用；以Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基體系和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基體系，用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了柚皮黃酮對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除效果。結(jié)果表明，柚皮苷的抗硝化作用較強(qiáng)，而蘆丁和橙皮苷沒(méi)有明顯的抗硝化作用；3種柚皮黃酮清除羥基自由基的效果在μg·mL－1水平就已經(jīng)比較顯著（超過(guò)50%），且顯示出濃度依賴(lài)性，作用大小依次為：柚皮苷＞橙皮苷＞蘆??；3種柚皮黃酮在μg·mL－1水平清除超氧陰離子自由基的作用大小依次為：蘆丁＞柚皮苷＞橙皮苷。

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