宮 魁, 王寶杰, 劉 梅, 蔣克勇, 邱楚雯, , 駱作勇, , 范瑞用,王 雷

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049; 3. 青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司, 山東 青島 266400)

刺參(Apostichopus japonicus)屬棘皮動(dòng)物門(Echinodermata), 海參綱(Holothuroidea)。目前刺參已成為我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)中產(chǎn)值最高的養(yǎng)殖品種。隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展, 病害問(wèn)題日趨突出, 其中以“爛嘴”、“吐臟”、“搖頭”、“化皮”等為主要特征的“刺參腐皮綜合征”頻繁發(fā)生, 不同程度地波及并危害到各主要刺參養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū), 每年造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]?？股睾突瘜W(xué)藥物在防治水產(chǎn)病害中雖然有其獨(dú)特的作用, 但長(zhǎng)期使用導(dǎo)致若干副作用, 如病原菌抗藥性, 內(nèi)源性感染和二重感染, 同時(shí)化學(xué)藥物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)殘留, 直接危害人類健康[2]。因此,減少抗生素及化學(xué)藥物的使用, 尋找替代藥劑, 發(fā)展生態(tài)養(yǎng)殖是刺參養(yǎng)殖業(yè)的必由之路。

作為微生態(tài)制劑的主要菌種, 乳酸菌在畜禽業(yè)已被廣泛應(yīng)用, 其具有無(wú)毒副作用、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、可替代抗生素等優(yōu)點(diǎn)。但其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較少, 作用機(jī)理不明確, 限制了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的推廣。本研究通過(guò)研究乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)刺參腸道菌群、非特異性免疫及特定生長(zhǎng)率影響, 初步探索在刺參養(yǎng)殖中的乳酸菌菌體與代謝產(chǎn)物所起益生作用, 以期為乳酸菌制劑在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌制劑

乳酸菌: 市售商品化菌種(干粉保存), 經(jīng)分析檢測(cè)為屎腸球菌(Enterococcus faecium)與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的混合菌種。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室活化后, 小型發(fā)酵罐中試發(fā)酵, 經(jīng)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)酵液活菌密度為4×109個(gè)/mL, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

乳酸菌代謝產(chǎn)物: 將乳酸菌發(fā)酵液置于-20℃冰箱保存48 h , 4℃, 6000 r/min, 30 min, 連續(xù)離心3次。經(jīng)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)其剩余乳酸活菌密度約為103個(gè)/mL。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用刺參由青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司提供, 為同一批孵化, 挑選規(guī)格基本一致的健康刺參,初始平均體質(zhì)量為(2.74 ± 0.17)g。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)管理

試驗(yàn)于青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司海參育苗場(chǎng)進(jìn)行。挑選個(gè)體規(guī)格一致的健康刺參, 隨機(jī)分為3組, 每組5個(gè)重復(fù), 分別放入5 m×3 m×1m的養(yǎng)殖池,每池布苗量為 40 kg。按照常規(guī)生產(chǎn)規(guī)程進(jìn)行管理,連續(xù)充氣, 每天14:00投喂一次餌料, 日投餌量為刺參體質(zhì)量的5%, 根據(jù)攝食、生長(zhǎng)及糞便情況隨時(shí)調(diào)整。每天換水 50%。試驗(yàn)期間水溫 13～15℃, pH7.83～8.14, 溶解氧5.7～6.8 mg/L。鮮海泥取自青島膠南瑯琊海域, 用量為干飼料質(zhì)量的 8倍。實(shí)驗(yàn)自 2011年 12月3日開始。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料(表1), 乳酸菌實(shí)驗(yàn)組添加 2mL/m3(按水體折算)乳酸菌制劑, 乳酸菌代謝產(chǎn)物組添加2 mL/m3(按水體折算)乳酸菌代謝產(chǎn)物。

表1 基礎(chǔ)飼料搭配比例Tab.1 Composition of experimental basal diets

1.3.2 微生物分析

每組隨機(jī)取3頭刺參, 無(wú)菌解剖取其腸道, 去除腸道糞便, 無(wú)菌生理鹽水充分沖洗后, 置于滅菌的玻璃勻漿器中, 加入適量無(wú)菌生理鹽水勻漿, 倍比稀釋,選擇合適的稀釋度取0.1mL, 分別接種2216E平板、麥康凱平板、TCBS平板和MRS平板, 并用無(wú)菌玻璃涂布棒涂布均勻, 培養(yǎng)適宜時(shí)間后, 進(jìn)行平板細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.3.3 免疫指標(biāo)

每組隨機(jī)取 20頭刺參, 解剖取體腔液, 吸取抗凝劑, 與體腔液體積比1:1混勻。所得體腔液, 一部分直接用于體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)、吞噬活性的測(cè)定; 另一部分離心10 min(3000r/min, 4℃)后棄上清, 用含0.1 mmol/L苯甲基磺酞氟的 PBS緩沖液將體腔細(xì)胞沉淀物重懸,VC130超聲波破碎儀(美國(guó))破碎(22kHz, 15～20s)懸液中的細(xì)胞, 4000 r/min, 4℃離心10 min, 所得上清液即為細(xì)胞破碎上清液(CLS), CLS用于堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活力的測(cè)定。上述酶活采用上海生工試劑盒進(jìn)行測(cè)定, 相關(guān)操作及計(jì)算均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。體腔液細(xì)胞的吞噬活性測(cè)定參考王斌等[3]方法, 將200μL體腔細(xì)胞在96孔板中貼壁30 min后, 棄上清, 每孔加入100 μL中性紅(體積分?jǐn)?shù)0.1%)吞噬30 min后, PBS緩沖液沖洗3遍, 洗去未被吞噬的中性紅, 加入 200 μL細(xì)胞裂解液裂解 20min,全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀540 nm處讀取吸光值, 結(jié)果以每108個(gè)細(xì)胞的吸光值來(lái)表示吞噬活性的高低。

1.3.4 特定生長(zhǎng)率

試驗(yàn)持續(xù)60 d, 分別在試驗(yàn)第20天、第40天和第 60天隨機(jī)取樣, 分析天平(精確度為 0.001g)稱質(zhì)量, 測(cè)定特定生長(zhǎng)率(RSG)。計(jì)算公式:

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用 spss16.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析, 多重比較采用 LSD法進(jìn)行。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參腸道菌群變化

表2 投飼乳酸菌及其代謝產(chǎn)物后刺參腸道菌群變化(M±SD)Tab.2 The changes of intestinal microflora after using probiotics(M±SD)

連續(xù)投飼20d, 兩實(shí)驗(yàn)組刺參腸道乳酸菌均顯著增多(P＜0.05); 40、60d, 兩實(shí)驗(yàn)組刺參腸道乳酸菌也有一定程度增多。在試驗(yàn)期間, 兩實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌菌落數(shù)均顯著減少(P＜0.05)?；【鲋骋嗍芤欢ㄒ种? 除40d,乳酸菌組弧菌量與對(duì)照組差異不顯著外, 兩實(shí)驗(yàn)組弧菌均顯著降低(P＜0.05)。刺參腸道異養(yǎng)菌總數(shù)在第40天差異顯著(P＜0.05), 其余時(shí)間差異不明顯(表2)。

2.2 免疫指標(biāo)

2.2.1 體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)

連續(xù)投飼乳酸菌與乳酸菌代謝產(chǎn)物, 乳酸菌實(shí)驗(yàn)組、代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體腔細(xì)胞含量差異不顯著, 表明乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)刺參體腔細(xì)胞數(shù)量影響不明顯(表3)。

表3 乳酸菌與其代謝產(chǎn)物對(duì)刺參體腔細(xì)胞的影響(M±SD)Tab. 3 The effects of lactic acid bacteria and its metabolites on coelomocyte of Apostichopus japonicus (M±SD)

2.2.2 體腔細(xì)胞吞噬活性

連續(xù)投喂乳酸菌及其代謝產(chǎn)物, 刺參體腔細(xì)胞吞噬活性明顯上升(P＜0.05)。其中乳酸菌實(shí)驗(yàn)組和代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組體腔細(xì)胞吞噬活性在40、60 d差異不顯著(表4)。對(duì)照組在20、40、60 d體腔細(xì)胞吞噬活性均顯著低于乳酸菌實(shí)驗(yàn)組和代謝產(chǎn)物組(P＜0.05)。

表4 乳酸菌與其代謝產(chǎn)物對(duì)刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的影響(M±SD)Tab. 4 The effects of lactic acid bacteria and its metabolites on phagocytic activity of coelomocyte (M±SD)

2.2.3 體腔細(xì)胞免疫酶活性

刺參ACP活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖 1。20、40、60 d活性乳酸菌組、代謝產(chǎn)物組與對(duì)照組刺參ACP差異顯著(P＜0.05), 且乳酸菌組與代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組 ACP活性差異均不顯著。表明投喂乳酸菌和乳酸菌代謝產(chǎn)物均可在一定程度上提高刺參體腔細(xì)胞ACP活性,且兩者之間差異不顯著。

刺參體腔細(xì)胞AKP活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。乳酸菌組與代謝產(chǎn)物組, 體腔細(xì)胞AKP活性在20、40、60 d差異均不顯著, 而對(duì)照組AKP活性顯著低于各實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。表明乳酸菌、乳酸菌代謝產(chǎn)物在本實(shí)驗(yàn)條件下, 均可顯著提高體腔細(xì)胞 AKP活性,且兩者差異不顯著。

圖1 乳酸菌與乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)刺參體腔細(xì)胞ACP的影響Fig.1 The effects of lactic acid bacterial and metabolites on ACP of coelomocytes

圖2 乳酸菌與乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)刺參體腔細(xì)胞AKP的影響Fig.2 The effects of lactic acid bacterial and metabolites on AKP of coelomocytes

乳酸菌與乳酸菌代謝產(chǎn)物均能促進(jìn)刺參體腔細(xì)胞LSZ活性(圖3)。但在20d, 乳酸菌實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 LSZ活性差異不顯著。40 d, 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組LSZ差異均不顯著。表明乳酸菌及乳酸菌代謝產(chǎn)物均能促進(jìn)體腔細(xì)胞 LSZ活性, 但作用效果可能受其他因素影響而不穩(wěn)定。

圖3 乳酸菌與乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)刺參體腔細(xì)胞LSZ的影響Fig.3 The effects of lactic acid bacterial and metabolites on LSZ of coelomocytes

2.3 特定生長(zhǎng)率

乳酸菌和乳酸菌代謝產(chǎn)物連續(xù)投喂稚參, 均可提高刺參特定增長(zhǎng)率(表5)。20～40 d, 乳酸菌實(shí)驗(yàn)組RSG顯著高于對(duì)照組(P＜0.05); 40～60 d, 乳酸菌代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組刺參RSG顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。在試驗(yàn)期間, 乳酸菌實(shí)驗(yàn)組與乳酸菌代謝產(chǎn)物組刺參RSG未表現(xiàn)出顯著差異。

表5 乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)刺參特定生長(zhǎng)率的影響(M±SD)Tab.5 The effects of lactic acid bacteria and its metabolites on RSG of Apostichopus japonicus (M±SD)

3 討論

目前針對(duì)乳酸菌的研究, 大多關(guān)注菌體與代謝產(chǎn)物共同作用效果[1-2,4], 未有分別針對(duì)乳酸菌菌體和乳酸菌代謝產(chǎn)物作用效果的研究。本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上, 將乳酸菌制劑中的菌體分離, 對(duì)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物和乳酸菌制劑作用效果進(jìn)行比較, 通過(guò)對(duì)比試驗(yàn), 比較乳酸菌制劑與代謝產(chǎn)物各自益生效果, 為揭示乳酸菌作用機(jī)理提供參考。雖前處理未能將乳酸菌活菌徹底去除, 但代謝產(chǎn)物中活菌含量遠(yuǎn)低于乳酸菌制劑(相差 106倍), 應(yīng)能通過(guò)刺參養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)比較乳酸菌菌體與發(fā)酵代謝產(chǎn)物各自所起益生功能。

動(dòng)物腸道菌群和腸黏膜結(jié)合形成的機(jī)械屏障、免疫屏障與生物屏障不僅發(fā)揮著保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用, 而且能有效防止致病物質(zhì)的入侵和菌群內(nèi)毒素的位移, 在維護(hù)機(jī)體健康方面起著至關(guān)重要的作用[4-9]。許禔森研究發(fā)現(xiàn), 在投喂短乳酸桿菌菌液和凍干菌粉后, 草魚腸道的短乳酸桿菌穩(wěn)定定殖,其數(shù)量呈上升趨勢(shì), 弧菌的數(shù)量下降[8]。曾地剛等發(fā)現(xiàn)投喂乳酸桿菌可有效抑制羅非魚腸道病菌的增殖[9]。胡毅等研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加芽孢桿菌顯著降低了凡納濱對(duì)蝦腸道和糞便中的弧菌[4]。上述研究多認(rèn)為, 外源有益菌可定殖于機(jī)體腸道, 通過(guò)與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn), 抑制有害菌繁殖, 進(jìn)而對(duì)腸道微生態(tài)產(chǎn)生有益調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn), 投喂乳酸菌及其代謝產(chǎn)物均能對(duì)刺參腸道菌群產(chǎn)生有益調(diào)節(jié), 腸道乳酸菌均有所提高, 與許禔森等人研究結(jié)果相同;而有害菌群如大腸桿菌與弧菌增殖均受到顯著抑制,與胡毅等人研究結(jié)論一致。但乳酸菌實(shí)驗(yàn)組與代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組兩者差異不顯著, 表明兩者之間應(yīng)有相同成分起到調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用。而乳酸菌代謝產(chǎn)物經(jīng)前處理后, 其活菌菌體顯著減少, 代謝產(chǎn)物大量留存, 表明兩者共有的乳酸菌代謝產(chǎn)物起到了調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的主要功能。且實(shí)驗(yàn)所用乳酸菌菌株來(lái)源于陸地, 前期研究發(fā)現(xiàn)其并不適于海洋環(huán)境,在刺參養(yǎng)殖環(huán)境下存活率很低(相關(guān)結(jié)果另文發(fā)表)。本研究中, 作者認(rèn)為并不是乳酸菌通過(guò)腸道定殖,與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài), 而是乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)刺參腸道菌群起主要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝產(chǎn)物中不僅有大量酸性物質(zhì), 且通常含有細(xì)菌素(bacteriocin)類物質(zhì)[10-11], 具有較好的抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)菌株由植物乳桿菌和屎腸球菌復(fù)合。屎腸球菌與植物乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中, 同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的乙酸、乳酸及大量活性抑菌物質(zhì), 這些發(fā)酵產(chǎn)物隨飼料進(jìn)入刺參消化道后, 降低腸道內(nèi)的pH和氧化還原電位值 Eh, 使腸道處于酸性環(huán)境, 拮抗病原性細(xì)菌, 從而抑制其增殖, 促進(jìn)乳酸菌等有益菌群的生長(zhǎng), 調(diào)節(jié)刺參腸道微生態(tài), 提高刺參抗感染能力。

棘皮動(dòng)物體腔細(xì)胞是棘皮動(dòng)物的免疫核心成分,其密度在一定程度上反映了棘皮動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)激能力或健康狀況[12]。而細(xì)胞吞噬作用在無(wú)脊椎動(dòng)物的抗菌防御中起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),投喂乳酸菌制劑及其代謝產(chǎn)物均未對(duì)刺參體腔細(xì)胞密度產(chǎn)生顯著性影響, 但體腔細(xì)胞吞噬活性有所提高。有研究發(fā)現(xiàn), 飼喂鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus), 可以顯著提高羅非魚細(xì)胞吞噬活性[13],本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果相近。乳酸菌制劑及乳酸菌代謝產(chǎn)物均對(duì)體腔細(xì)胞吞噬活性有積極影響, 可能與乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物促進(jìn)刺參吞噬細(xì)胞活性有關(guān), 具體作用機(jī)理還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

刺參作為低等動(dòng)物, 其免疫系統(tǒng)不完善, 主要依靠非特異性免疫來(lái)提高對(duì)病原的抵抗力。ACP、AKP與 LSZ是反映刺參免疫能力的重要指標(biāo), 在刺參防御體系中發(fā)揮重要的作用。Gullia等發(fā)現(xiàn)投喂腸道分離芽孢桿菌, 顯著提高對(duì)蝦血清酚氧化酶活力[14]。Salinas等[15]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和乳酸菌對(duì)烏頰魚免疫效果具有較好的促進(jìn)作用。王永勝等[16]用益生菌飼喂凡納濱對(duì)蝦時(shí)實(shí)驗(yàn)組溶菌酶、堿性磷酸酶、氧化物歧化酶等指標(biāo)方面均高于對(duì)照組。上述對(duì)益生菌的研究, 多發(fā)現(xiàn)其能有效促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫酶活性, 但未揭示菌體還是代謝產(chǎn)物或者二者共同對(duì)免疫酶活發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)中, 乳酸菌制劑和乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)刺參ACP、AKP和LSZ活性均有顯著促進(jìn), 且兩者之間對(duì)上述酶活影響差異不顯著, 對(duì)刺參免疫酶活作用效果與上述研究一致。本實(shí)驗(yàn)表明, 含乳酸菌活菌的乳酸菌制劑和去乳酸菌菌體的代謝產(chǎn)物之間對(duì)刺參免疫酶活影響差異較小, 作為兩者共有的代謝產(chǎn)物, 起到了主要促進(jìn)刺參免疫酶活性的作用。而本實(shí)驗(yàn)所用乳酸菌菌體對(duì)刺參免疫酶活所起作用很小, 或可忽略不計(jì)。

實(shí)驗(yàn)采用SGR作為生長(zhǎng)指標(biāo), 可很好的描述動(dòng)物當(dāng)時(shí)的生長(zhǎng)趨勢(shì)。乳酸菌能產(chǎn)生 B族維生素, 包括葉酸、生物素、維生素B6和維生素K等, 能夠直接為宿主提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[17]。有研究認(rèn)為, 益生菌促生長(zhǎng)機(jī)理可能與飼喂益生菌后動(dòng)物機(jī)體腸道消化酶活性的提高有關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)中,乳酸菌和代謝產(chǎn)物對(duì)刺參RSG均有所提高。表明乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)刺參生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。刺參消化道相對(duì)比較簡(jiǎn)單, 對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化體系不完善,通過(guò)在飼料中添加適量乳酸菌制劑, 可補(bǔ)充刺參消化體系中的不足, 促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用率, 從而提高刺參RSG, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)的結(jié)論相同。

綜上, 乳酸菌與乳酸菌代謝產(chǎn)物之間對(duì)刺參腸道菌群、非特異性免疫與 SGR影響差異較小, 但均顯著優(yōu)于對(duì)照組。表明本實(shí)驗(yàn)所采用乳酸菌制劑, 其代謝產(chǎn)物在對(duì)刺參的益生影響中發(fā)揮主要作用。需注意的是, 本實(shí)驗(yàn)未能將發(fā)酵液中的乳酸菌活菌徹底去除, 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論可能有所干擾。探明有益菌菌體與代謝產(chǎn)物之間各自對(duì)刺參所起益生作用, 尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

[1]宋愛(ài)環(huán), 李成林, 朱虎, 等. 刺參養(yǎng)殖池塘中一株益生芽孢桿菌的分離及鑒定[J]. 海洋科學(xué), 2011, 35 (5): 38-41.

[2]王亞敏, 王印庚. 微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29 (6):72-75.

[3]王斌, 趙文, 范薇, 等. 復(fù)方中藥制劑對(duì)草魚免疫細(xì)胞功能及抗病力影響的初步研究[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 22(3): 203-206.

[4]胡毅,譚北平, 麥康森, 等. 飼料中益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、腸道菌群及部分免疫指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2008, 15(2): 244-251.

[5]雷春龍, 董國(guó)忠. 腸道菌群對(duì)動(dòng)物腸黏膜免疫的調(diào)控作用[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2012,24(3): 416-422.

[6]Balcázar J L, Blas I D, Ruiz-Zarzuela I, et al. Review:The role of probiotics in aquaculture [J]. Veterinary Microbiology, 2006, 114: 173-186.

[7]Vine N G, Leukes W D, Kaiser H, et al. Competition for attachment of aquaculture candidate probiotic and pathogenic bacteria on fish intestinal mucus [J]. Journal of Fish Diseases, 2004, 27(6): 319-326.

[8]許禔森. 短乳酸桿菌對(duì)草魚幼魚養(yǎng)殖水體和腸道菌群的影響[J]. 德州學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 24(2): 60-63.

[9]曾地剛, 雷愛(ài)瑩. 乳酸桿菌對(duì)羅非魚生長(zhǎng)和抗病力的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011,42 (3): 328-331.

[10]Cintas L M, Casaus P, Holo H , et al. Enterocins L50A and L50B, two novel bacteriocins fromEnterococcus faeciumL50, are related to staphylococcal hemolysins[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 180(8): 1988-1994.

[11]Laukov M M. Partial characterization of bacteriocins produced by environmental strainEnterococcus faeciumEK13 [J]. Journal of Applied Microbiology,2003, 94(3): 523-530.

[12]常杰, ?；? 張文兵. 刺參免疫系統(tǒng)及其免疫增強(qiáng)劑評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)飼料, 2011, 6: 8-12.

[13]Pirarat N, Kobayashi T, Katagiri T, et al. Protective effects and mechanisms of a probiotic bacteriumLactobacillus rhamnosusagainst experimentalEdwardsiella tardainfection in tilapia (Oreochromis niloticus)[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2006, 113(3-4), 339-347.

[14]Gullian M, Thompson F, Rodriguez J. Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect inPenaeus vannamei[J]. Aquaculture, 2004, 233(1-4): 1-14.

[15]Salinas I, Cuesta A, Esteban M. Dietary administration ofLactobacillus delbrùeckiiandBacillus subtilis, single or combined, on gilthead seabream cellular innate immune responses [J]. Fish and Shellfish Immunology, 2005,19(1):67-77.

[16]王永勝, 錢魯閩. 三類免疫制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫效應(yīng)的研究[J]. 臺(tái)灣海峽,2006, 25 (1): 41-47.

[17]王玉堂. 乳酸菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)水產(chǎn), 2009,10: 56-58.

[18]Ziaei-Nejad S, Habibi R M, Takami G A, et al. The effect ofBacillusspp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimpFenneropenaeus indicus[J].Aquaculture, 2006, 252: 516-524.