李秉鈞, 吳志昊, 尤 鋒, 王 波, 徐 彬

(1. 煙臺大學 海洋學院, 山東 煙臺264005; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 國家海洋局第一海洋研究所, 山東 青島 266061)

鋼頭鱒(Oncorhynchus mykiss)俗稱鋼頭三文魚、丹虹三文魚、鋼頭、鋼頭鮭、三文鱒等, 屬于鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、鮭亞科(Salmoniae)、大麻哈魚屬(Oncorhynchus)。與虹鱒為同一種的不同品系, 其生活史的大部分時間在大洋或大湖區(qū)度過, 具有洄游性, 繁殖時溯河產卵; 而虹鱒為陸封型的, 不需要在不同水體間進行長距離洄游[1]。鋼頭鱒經過馴化也可以完全在淡水中生長繁殖,無需洄游[2]。從外部形態(tài)看, 鋼頭鱒沿體側側線下半部為銀白色, 上半部為暗綠色, 頭背部則為鐵灰色,身上斑點大而稀疏[3]; 而虹鱒成體沿體側側線有一明顯的棕紅色縱紋, 如同彩虹一樣, 也因此得名“虹鱒”。鋼頭鱒的肉質爽滑且結實, 肉呈鮮橙色, 可做成與極品鮭魚相媲美的生魚片, 經濟價值很高。在加拿大、美國、丹麥、英國、智利等國家都已經開展了大規(guī)模養(yǎng)殖[4-7]。北京康鑫水產公司1998年從美國將類似種硬頭鱒引進中國, 并在北京密云水庫成功地進行了培育[8]。由于其養(yǎng)殖業(yè)經濟效益突出, 近幾年在中國各省逐步推廣, 也開展了苗種培育技術、重金屬的急性毒性實驗、細胞體外培養(yǎng)、三倍體誘導等相關的研究[3,9-11]。作者所分析的鋼頭鱒是丹麥降海型 DK新品系之一, 它與國內以前引進并已開展大規(guī)模養(yǎng)殖的陸封型虹鱒品種, 如金鱒、硬頭鱒、道納爾遜優(yōu)質虹鱒等均屬于同一物種虹鱒的不同品系, 具有耐高溫、易海水馴化、速生、抗病、高產等特點, 因而更具廣闊的養(yǎng)殖前景。

染色體作為生物體中遺傳物質的載體, 能在一定程度上反映物種的分化與形成過程、親緣關系、演化途徑及進化歷史等特征[12]。所以, 有必要弄清鋼頭鱒的染色體核型和遺傳背景, 為進一步開展該魚種種質、遺傳育種研究和養(yǎng)殖生產打下良好基礎。鮭亞科魚類共5屬22種[13], 其染色體主要分兩種類群, 一類二倍體染色體數接近 80, 臂數約為100(2n=80,NF=100); 另一類二倍體染色體數接近60,臂數也約為100(2n=60,NF=100)[14]。有關鋼頭鱒的核型研究報道不多, Colihueque等[6]曾對5個品系的虹鱒染色體數進行了統(tǒng)計, 發(fā)現硬頭鱒的染色體數在58～61, 但并未進行染色體組型分析; 國內則僅有對其紅血細胞核大小和形狀變化的研究[15], 也未見到其染色體核型的報道。作者通過由丹麥引進的鋼頭鱒的染色體數目和核型研究, 以期獲得其細胞遺傳學基礎參數。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

所用實驗魚耐高溫鋼頭鱒由國家海洋局第一海洋研究所2011年從丹麥引進, 共10尾, 包括5尾雌魚和5尾雄魚, 體質量為90～150 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 染色體分裂相制備

采用稍加修改的PHA活體直接注射法制備染色體標本[16]。按 5 μg/g魚體質量活體往腹腔內注射PHA, 20 h后按2.5 μg/g魚體質量注射秋水仙素溶液,3 h后斷尾放血, 解剖取其頭腎并用生理鹽水沖洗2次,充分剪碎后, 用 200目尼龍網過濾細胞懸液至刻度離心管中, 經低滲、固定、滴片、自然干燥、Giemsa染色等處理后, 光學顯微鏡下觀察、計數、測量和拍照。

1.2.2 核型分析

核型分析選取實驗魚的染色體中期分裂相50個進行染色體計數(3～6個/尾實驗魚), 并選出 10個分散良好的中期分裂相進行染色體配對和長度測量,根據Levan等[17]的標準進行核型分析。染色體相對長度計算公式; 染色體相對長度=(實測單條長度×2/全部染色體長度總和)×100。利用測得的染色體相對長度, 在Excel中繪制實驗魚的核型模式圖[18]。

2 結果

2.1 染色體數目的確定

在顯微鏡下對鋼頭鱒中期分裂相進行計數,共計數50個分裂相, 其染色體總數為58, 即2n=58(表1)。雌魚和雄魚染色體數目無差異, 也未觀察到異形染色體。

表1 鋼頭鱒染色體數目統(tǒng)計結果Tab. 1 Chromosome numbers of Domsea steelhead trout O.mykiss

表2 鋼頭鱒染色體相對長度和臂比值Tab. 2 Relative length and ratio of chromosomes of Domsea steelhead trout O. mykiss

2.2 染色體相對長度的分析

對實驗魚的10個分散良好的中期分裂相進行顯微攝像, 統(tǒng)計獲得的染色體的相對長度和臂比見表 2,實驗魚中期染色體相對長度最長為(5.69±0.17), 最短為(1.92±0.09)。染色體配對和核型分析如圖1, 染色體組型為 2n=44m+14t, 臂數NF=102。對實驗魚的 29對同源染色體按相對長度遞減趨勢進行編號, 獲得了染色體核型模式圖(圖2)。

圖1 鋼頭鱒染色體中期分裂相(左)和核型(右)Fig.1 Metaphase chromosomes (left)and karyotype (right)of Domsea steelhead trout O. mykiss

圖2 鋼頭鱒的核型模式圖Fig.2 The schema chart of chromosome of Domsea steelhead trout O. mykiss

3 討論

染色體是遺傳物質的主要載體, 特定的生物體具有特定數目、形態(tài)特征的染色體, 一般認為魚類染色體的核型結構與其演化程度是一致的[12]。小島吉雄[19]按染色體形態(tài)將真骨魚類劃分為低位類、中位類和高位類3個演化類群。高位類群的魚類染色體的特點是其數目分布呈收斂狀態(tài), 較集中, 峰值是2n=48,M型染色體(包括m和sm染色體)少, 平均為7.5; A型染色體(包括st和t染色體)多, 平均為38.3, NF平均值為53.4; 而低位類群的魚類染色體的數目相對較多, M型染色體多而A型染色體少。鮭科魚類屬典型的冷水性魚類, 約有36種, 是世界三大養(yǎng)殖魚類之一, 其養(yǎng)殖產量僅在鯉魚和羅非魚之后[20]。國內外許多研究均認為鮭形目魚類是多倍體起源的魚類, 在進化過程中經歷了四倍化的進程[21]。目前已有染色體核型相關報道的鮭科魚類中, 染色體數總體變化較大(表3)。其中白點鮭(Salvelinus pluvius)、哲羅鮭(Hucho taimen)和高白鮭(Coregonus peled)染色體數較多, 屬于低位類群; 孟蘇大馬哈魚(Oncorhynchus masu)、虹鱒和鋼頭鱒雖然染色體數略少于以上3種魚, 但其M型染色體相對較多(超過70%), 其演化類群也趨向低位類群; 大西洋鮭(Salmo salar)的染色體數為56, M型染色體相對較少, 僅占32%, 其演化類群相對其他鮭科魚類趨向高位類群。但其染色體數與高位類群魚類染色體數的峰值48相比仍不夠收斂, 并不能將其劃分為高位類群。因此, 無法將鮭科魚類在魚類系統(tǒng)進化上統(tǒng)一歸于某一位類群。李樹深[22]研究認為,在特定的分類階元中, 具有較多端部著絲粒染色體的為原始類群; 而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的為特化類群, 其中臂數少的為較特化類群,臂數多的為特化類群。在已報道的鮭科魚類中(表3),染色體核型表現出高度的多樣性, 進化并不保守。大西洋鮭具有較多端部著絲粒染色體, 屬于較原始的類群。而虹鱒和鋼頭鱒具有較多中部或亞中部著絲粒, 屬于特化類群。這種染色體數目和形態(tài)的差異可能是不同物種由于隔離造成的長期的基因交流缺失導致的。Philips等[14]在對鮭科魚類的染色體進化研究表明, 魚類棲息的環(huán)境對其染色體多態(tài)性有很大影響。

表3 幾種鮭科魚類的染色體核型Tab. 3 Chromosomal numbers and karyotypes of some species of Salmonidae

作者研究的鋼頭鱒為丹麥學者經過幾十年選育出來的降海型新品系。不同品系的虹鱒除在外形上略有差異外, 在染色體核型上也存在一定差異。對于不同品系虹鱒染色體數目的研究已有較多報道,1955年Wright[29]首次利用囊胚細胞研究了虹鱒的染色體, 顯示其染色體數為 60。之后又有許多學者研究了不同虹鱒地理群體或品系的核型, 得到不盡相同的結果。Minciu等[30]對采自羅馬尼亞的兩個虹鱒群體染色體的研究發(fā)現其數目在群體間存在差異,有 2n=60和 2n=61兩個群體。Vasilyev等[31]發(fā)現勘察加半島的虹鱒染色體數目為 2n=62。Thorgaard[32]分析了從阿拉斯加到加利福尼亞的 29個虹鱒群體,發(fā)現其染色體數目從 58～64不等。Colihueque等[6]對包括硬頭鱒在內的 5個虹鱒品系染色體數進行了統(tǒng)計, 發(fā)現它們的染色體數在 58～63, 其中硬頭鱒的染色體數在58～61。作者所分析的鋼頭鱒染色體數目為 58。這種不同品系間染色體數目的差異可能與羅伯遜易位(Robertsonian translocation)有關。羅伯遜易位現象是指同一細胞核內兩條端部著絲點染色體在著絲點位置融合為一條中部或亞中部著絲點染色體,以及由一條中部或亞中部著絲點染色體在著絲點處斷裂為兩條端部著絲點染色體的現象, 這一變化或易位是正反兩方向變化的。從物種進化看, 羅伯遜易位會導致種內出現染色體核型的多樣性, 再經過一定的地理隔離, 這些具有不同染色體核型的群體間經過獨立的進化, 進而衍生出亞種, 乃至新物種[33]。

已有文獻報道[26], 虹鱒屬雌性同配雄性異配型XX-XY, 但是否有異形性染色體還缺乏足夠的證據,目前大多研究報道中均未發(fā)現性染色體, 僅Thorgaard[34]發(fā)現虹鱒雄性個體的亞端部著絲點染色體在短臂存在異形現象, 并認為其為虹鱒性染色體分化的早期階段。本研究中同時對雄性和雌性剛頭鱒的染色體分裂相進行了觀察, 也未發(fā)現異形染色體。

[1]楊貴強, 徐紹剛, 王躍智,等. 硬頭鱒幼魚部分形態(tài)性狀和體重的關系[J]. 動物學雜志, 2011, 46(1): 16-22.

[2]Neal G A, Edward R S, Doran M M. Diet, feeding rate,growth, mortality, and production of juvenile steelhead in a Lake Michigan Tributary[J]. North American Journal of Fisheries Management, 2007, 27: 578-592.

[3]徐紹剛, 田照輝, 楊貴強. 硬頭鱒苗種培育技術[J].中國水產, 2009, 4: 47-48.

[4]Palstra P F, O’Connell F M, Ruzzante E D. Population structure and gene flow reversals in Atlantic salmon(Salmo salar)over contemporary and long-term temporal scales: effects of population size and life history[J]. Molecular Ecology, 2007, 16: 4504-4522.

[5]Fleming A I, Jonsson B, Gross R M. Phenotypic divergence of sea-ranched, farmed, and wild salmon[J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,1994, 51: 2808-2824.

[6]Colihueque N, Iturra P, Estay F, et al.Diploid chromosome number variations and sex chromosome polymorphism in five cultured strains of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J]. Aquaculture, 2001, 15:63-77.

[7]Volpe1 P J, Taylor B E, Rimmer W D, et al. Evidence of natural reproduction of aquaculture-escaped Atlantic salmon in a coastal British columbia river[J]. Conservation Biology, 2000, 14: 899-903.

[8]劉澧津. 硬頭鱒(Oncorhynchus mykiss)苗種養(yǎng)殖試驗[J]. 水產學雜志, 2001, 14(2): 72-74.

[9]童裳亮. 硬頭鱒巨噬細胞的體外長期培養(yǎng)[J]. 實驗生物學報, 22(2): 241-245.

[10]蔡國雄, 伊格·所羅, 愛德華·唐納森. 熱休克和水靜壓刺激誘導三倍體硬頭鱒(Oncorhynchus mykiss)對比研究[J]. 水產學雜志, 1990, 3(2): 31-352.

[11]姚再旺. 日本研究鋅對硬頭鱒的急性毒性[J]. 水產科技情報, 1984 (1): 26.

[12]余先覺, 周暾, 李渝成. 中國淡水魚類染色體[M].北京: 科學出版社, 1989.

[13]孟慶聞, 蘇錦祥, 繆學祖. 魚類分類學[M]. 北京: 科學出版社, 1994, 309-318.

[14]Philips R, Rab P. Chromosome evolution in the Salmonidae(Pisces): an update[J]. Biological Reviews,2001, 7: l-25.

[15]蔡國雄. 硬頭鱒(Oncorhynchus mykiss)早期發(fā)育過程中紅血細胞核的尺度變化和類型轉換[J]. 水產學雜志1996, 9(1): 1-6.

[16]林義浩.快速獲得大量魚類腎細胞中期分裂相的 PHA體內注射法[J]. 水產學報, 1982, 6(3): 201-208.

[17]Levan A, Fredga K, Sandberg A A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J]. Hereditas,1964, 52(2): 201-220.

[18]喬永剛, 宋蕓. 利用 EXCLE制作核型模式圖[J]. 農業(yè)網絡信息, 10: 97-98.

[19]小島吉雄. 魚類細胞遺傳學[M]. 廣州: 廣東科技出版社, 1985.

[20]孫大江, 王炳謙. 鮭科魚類及其養(yǎng)殖狀況[J]. 水產學雜志, 2010, 23(2): 56-63.

[21]Ojima Y, Takai A. The occurrence of spontaneous polyloidy in the Japanese common loach,Misqurnus anguicandatus[J]. Proceedings of the Japan Academy,1979, 55: 487-491.

[22]李樹深. 魚類細胞分類學[J]. 生物科學動態(tài), 1981, 2:8-15.

[23]王清印, 余來寧, 楊寧生. 中國水產生物種質資源與利用(第1 卷)[M]. 北京：海洋出版社, 2005, 47-55.

[24]薛淑群, 尹洪濱, 尹家勝. 哲羅魚(Hucho taimen)染色體組型與 DNA 含量分析[J]. 廣東海洋大學學報,2010, 30(3): 6-10.

[25]薛淑群, 孫中武, 尹洪濱. 高白鮭的細胞遺傳學分析[J]. 水生生物學報, 2011, 35(5): 869-873.

[26]宋蘇祥, 孫大江, 劉洪柏. 虹鱒魚核型及 DNA 含量分析[J]. 水產學雜志, 1995, 8 (1): 27-31.

[27]尹洪濱, 牟振波, 孟繁華. 大西洋鮭的染色體核型[J].東北林業(yè)大學學報, 2003, 31(1): 27-28.

[28]虎永彪, 張艷萍, 婁忠玉, 等. 美洲紅點鮭染色體核型分析[J]. 水產科技情報, 2010, 37(3): 154-156.

[29]Wright E J. Chromosome numbers in trout[J]. The Progressive Fish-Culturist, 1955, 17(4): 172-176.

[30]Minciu R D, Bara I. A study of mitotic chromosomes of two populations ofSalmo gairdneri[J].Rich Revue Roumaine de Biology, 1986, 3l(1): 55-59.

[31]Vasilyev P V. Karyotypes of different forms of the kamchatka trout,Salmo mykissand the rainbow trout,Salmo gairdneri[J].Ichology, 1975, 15: 889-900.

[32]Thorgaard H G. Chromosomal differences among rainbow trout populations[J].Copeia, 1983, 3: 650-662.

[33]朱必才, 高煥, 屈艾,等.羅伯遜易位研究的進展[J].遺傳, 2001, 23(6): 599-604.

[34]Thorgaard H G. Heteromorphic sex chromosomes in male rainbow trout[J].Science, 1977, 196: 900-902.