馬淑芹 張慶波 李博 幺文博 胡萬寧 楊雷 王宗會 王靜怡

癌癥嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，食管癌是其之一，我國食管癌病死率為15.02/10萬，在我國居惡性腫瘤的第四位。傳統(tǒng)的癌癥治療方法是手術(shù)、放療和化療，但均存在有一定的缺點(diǎn)和不足，由于腫瘤本身的侵襲和復(fù)發(fā)的生物學(xué)系特性，使治療效果受限。隨著免疫學(xué)理論和分子生物學(xué)知識的不斷發(fā)展和突破，腫瘤生物療法成為控制和消除腫瘤的新途徑，腫瘤免疫療法是腫瘤生物療法的重要組成部分。本研究應(yīng)用超抗原金葡素C型(staphlococcal enterotoxin，SEC)聯(lián)合食管癌腫瘤可溶性抗原(tumor soluble antigen，TSA)構(gòu)建腫瘤疫苗，刺激PBMC增值，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cyctotoxic T lymphocyte，CTL)，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，并對其有效成分進(jìn)行分析，以探討其治療癌癥的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：PBMC分離液(天津TBD公司)，RPMI-1640(Gibco公司)，超抗原SEC(購于沈陽協(xié)和集團(tuán))，CCK-8(武漢碧云天公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD19/CD3/CD4/CD8(美國BD公司)，ELISA試劑盒(美國R＆D公司)，3H-Tdr(中科院原子能所)。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞系：人食管癌細(xì)胞株Eca109，宮頸癌細(xì)胞株Hela，由河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分離：取正常獻(xiàn)血者外周血10ml，肝素抗凝，用Ficoll細(xì)胞分離液(比重：1.077)分離PBMC。用生理鹽水洗細(xì)胞三次，計數(shù)細(xì)胞數(shù)，置于含10%人AB型血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.2.2 食管癌抗原的制備：培養(yǎng)食管癌細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗細(xì)胞一次(1 000 r/min)，加入3mol/L KCl(破碎細(xì)胞)，4℃搖床振搖過夜，12 000 r/min離心，取上清，透析，離心，取上清加入等量4 mmol/L硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，透析，去除硫酸銨，用紫外分光光度計280 nm波長下測定蛋白含量，作為腫瘤可溶性抗原(TSA)。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌，保存 -80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PBNC增殖的測定：實(shí)驗(yàn)分4組：A組：PBMC，B組：SEC+PBMC，C 組：TSA+PBMC，D 組：腫瘤疫苗(SEC+TSA)+PBMC，SEC 濃度0.1 ng/ml，TSA 濃度50 μg/ml。用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為106/ml，接種于96孔板，每孔100μl，每組設(shè)3復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，CCK-8比色法測定細(xì)胞增殖。

1.2.4 細(xì)胞表型分析：RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)PBMC濃度為106/ml，接種于6孔板，每孔2 ml。按上述分組，每組4孔，培養(yǎng)第6天，每組各孔分別加入FITC標(biāo)記的CD3，CD4，CD8單克隆抗體，F(xiàn)CM檢測。

1.2.5 細(xì)胞毒活性檢測：4組增值的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞(細(xì)胞濃度為2×106/ml)，分別作用于靶細(xì)胞Eca109(1×105)和Hela(1×105)，效∶靶=20∶1，另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照組和靶細(xì)胞對照組，每組3復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，CCK-8法測各組效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率。

細(xì)胞殺傷率(%)=［1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞組OD值)］/靶細(xì)胞組OD值 ×100%。

1.2.6 食管癌抗原有效成分分析：提取食管癌的細(xì)胞膜抗原(mAg)、熱休克蛋白 70(HSP70)、DNA、RNA和細(xì)胞內(nèi)多肽(Peptides)，并用于誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)增殖，培養(yǎng) 6 d，用 3H-Tdr摻入法測定細(xì)胞增值。

將分離的PBMC置于含10%人AB型血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)細(xì)胞濃度1×106/ml，置于24孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，將上述各成分按 20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15μg/ml的終濃度加入到 PBMC中，37℃，5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，3 d后換液，加入新鮮培養(yǎng)液和相同濃度的抗原，混勻后，轉(zhuǎn)入96孔平底培養(yǎng)板(每孔200μl，設(shè)3個平行孔)，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收獲細(xì)胞前16～18 h加入0.5μCi/ml的3H-Tdr，用細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃硝酸纖維濾紙上，β計數(shù)儀測定cpm數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞增殖分析 在72h之前，4組淋巴細(xì)胞增殖能力隨時間的增加而增強(qiáng)，各實(shí)驗(yàn)組均于72 h時細(xì)胞增殖達(dá)高峰;但到96 h時，細(xì)胞增殖趨勢開始下降。同一時間點(diǎn)，4組細(xì)胞增殖能力也不同，經(jīng)食管癌腫瘤疫苗刺激的D組與A、B、C組比較，細(xì)胞增殖活性最高，于72 h達(dá)到高峰(P＜0.05)。見圖1。

圖1 4組細(xì)胞增殖分析

2.2 熒光染色分析 4組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，用熒光抗體染色，進(jìn)行細(xì)胞表型分析，4組CD3均表達(dá)為陽性，表明所誘導(dǎo)的細(xì)胞為T細(xì)胞。對照組A的CD8只有25.44%，而B、C、D 3組較之明顯升高(P＜0.05)，D組誘導(dǎo)的CD8+最高，為42.10%，說明所誘導(dǎo)的細(xì)胞為CD8+CTL細(xì)胞。見表1。

表1 細(xì)胞表型分析%，±s

表1 細(xì)胞表型分析%，±s

注：與A組比較，*P＜0.05

組 C組 81.24±1.84 43.19±0.91 35.30±2.94*D組 85.24±1.90 46.55±2.80 42.10±3.94*

2.3 細(xì)胞毒活性檢測 經(jīng)腫瘤疫苗(TSA+SEC)刺激的D組誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs對靶細(xì)胞Eca109殺傷活性顯著高于A組(P＜0.01)，效應(yīng)細(xì)胞對Eca109的殺傷率明顯高于對Hela的殺傷率(P＜0.01)，表明D組具有高效、特異性的殺傷作用。見表2。

表2 效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞系的殺傷率比較%，±s

表2 效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞系的殺傷率比較%，±s

注：與D組比較，*P ＜0.01;與Eca109比較，*P ＜0.01

C組 82.6±3.9 80.2±2.7 D組 96.9±7.5 84.7±6.6*

2.4 食管癌抗原免疫活性成份分析 食管癌可溶性抗原能夠誘導(dǎo)PBMC增值，表明TSA具有免疫原性。其主要活性成分是細(xì)胞內(nèi)多肽、細(xì)胞膜蛋白，其他成分則不具有免疫原性。見表3。

3 討論

腫瘤抗原的存在是機(jī)體識別腫瘤并激活免疫系統(tǒng)的物質(zhì)性低下，不被免疫系統(tǒng)識別，不能有效刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，使腫瘤處于免疫逃逸狀態(tài)［1］。近年來，提高腫瘤疫苗免疫原性的方法有很多，如增強(qiáng)MHC-肽復(fù)合物的穩(wěn)定性，增強(qiáng)共刺激信號的表達(dá)、使用免疫佐劑、超抗原等。金葡菌腸毒素(staphlococcal enterotoxin，SE)是一種具有高度生物活性的蛋白質(zhì)，是目前研究較多的細(xì)菌性超抗原(super antigen，SAg)，SE能同時結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)和T細(xì)胞識別受體(TCR)而連接抗原遞呈細(xì)胞(APC)，因其不需要APC的內(nèi)處理，在MHCⅡ的抗原結(jié)合槽的外側(cè)直接與之特異性結(jié)合，并通過結(jié)合T細(xì)胞受體Vβ片段(TCRVβ)的不同片段高效的激活T細(xì)胞，促使分泌大量及多種細(xì)胞因子［2，3］，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接和間接的殺傷和抑制作用，實(shí)驗(yàn)研究效果較好［4，5］，但單純應(yīng)用超抗原SE沒有靶向作用［6］。本研究將腫瘤可溶性抗原與超抗原SEC聯(lián)合作用T細(xì)胞，可以保證腫瘤抗原被有效攝取提呈，且可提高共刺激信號，誘導(dǎo)針對腫瘤抗原的CTL應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤全溶物與超抗原SEC聯(lián)合應(yīng)用具有更為強(qiáng)大的活化效應(yīng)細(xì)胞的能力，對靶細(xì)胞的殺傷率更為明顯，顯示出一定的抗腫瘤免疫治療應(yīng)用前景。

由食管癌可溶性抗原和金葡菌超抗原構(gòu)建的腫瘤疫苗，能顯著地誘導(dǎo)PBMC活化、增殖，產(chǎn)生高效、特異的CTL，具有特異性的免疫活性成分是細(xì)胞膜抗原和細(xì)胞內(nèi)多肽。此研究為腫瘤疫苗的構(gòu)建奠定了理論基礎(chǔ)?；A(chǔ)，由于腫瘤細(xì)胞缺乏一種或多種抗原成分，導(dǎo)致其免疫原

表3 腫瘤可溶性抗原免疫活性成分分析

1 Smyth MJ，Godfrey DI，Trapani JA.A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.Nat Immunol，2001，2：293-299.

2 Wen R，Cole GA，Surman S，etal.Major histocompatibility complex classⅡ-associated peptides control the presentation of bacterial superantigens to T cell.JExp Med，1996，183：1083-1092.

3 Woodland DL，Wen R，Blackman MA.Why do superantigens care about peptides?Immunol Today，1997，18：18-22.

4 Perabo FG，Willen PL，Wirger A，etal.Preclinical evaluation of superantigen(staphylococcal enterotoxin B)in the intravesical immunotherapy of Superficial bladder cancer.Int JCancer，2005，115：591-598.

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6 韓從輝，鄭寶鐘，田軍，等.超抗原誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞體內(nèi)外對膀胱腫瘤的殺傷作用研究.中華腫瘤雜志，2000，23：392.