崔文華 底建敏 張國華 陳冀英

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在妊娠期活動(dòng)性感染可經(jīng)宮內(nèi)傳播，可導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒畸形、死胎、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、先天性智力低下、聽力損害、小頭畸形、顱內(nèi)鈣化、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎以及出生后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后等［1，2］。治療孕期HCMV活動(dòng)性感染是阻斷HCMV宮內(nèi)傳播，預(yù)防HCMV宮內(nèi)感染重要手段。但目前缺乏安全有效治療藥物。我們研究證實(shí)：JYBD具有抗HCMV和豚鼠巨細(xì)胞病毒作用［3，4］，因它為中藥復(fù)方制劑，成分較多，藥理作用復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，抗病毒分子機(jī)制不明。小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)與HCMV生物學(xué)特征相似，故通過研究，JYBD對(duì)MCMV感染及影響因素，來推測(cè)JYBD對(duì)HCMV致病分子機(jī)制，中藥JYBD制劑是否影響MCMV感染細(xì)胞的病變情況及HSP70表達(dá)，是否通過影響MCMV感染細(xì)胞HSP70表達(dá)而發(fā)揮抗病毒作用，我們通過選體外實(shí)驗(yàn)方法，觀察中藥JYBD制劑對(duì)MCMV感染細(xì)胞的病變情況及HSP70表達(dá)影響。以探討中藥JYBD制劑抗病毒分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞：病毒MCMV Smith株購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，按常規(guī)方法滴定，并測(cè)定半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)。小鼠胚肺細(xì)胞NIH3T3株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：中藥JYBD注射劑，20 ml/Amp，含生藥量1 g/ml，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。陽性?duì)照藥物：更昔洛韋(GCV)粉針劑，50 ml/支。

1.1.3 主要試劑：高糖MDEM培養(yǎng)基為美國Gibico公司產(chǎn)品，鼠抗鼠HSP70 McAb為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，生物素化山羊抗鼠IgG及SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒毒力測(cè)定：常規(guī)測(cè)定MCMV Smith株TCID50=10-5。

1.2.2 藥物毒性試驗(yàn)：用MTT、細(xì)胞病變法測(cè)JYBD、GCV最大無毒濃度TD0，兩種方法測(cè)得結(jié)果一致，JYBD TD0為5 mg/ml，GCVTD0為100 μg/ml。

1.2.3 NIH/3T3細(xì)胞培養(yǎng)：將NIH/3T3細(xì)胞以1.00×106/ml接種25ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)成功后，留取約1.00×106/ml細(xì)胞于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，其余細(xì)胞待接種入十二孔板。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)步驟：將NIH/3T3細(xì)胞分別植于7個(gè)鋪有蓋玻片12孔板，每一12孔板分別設(shè)有正常細(xì)胞組、病毒感染組、JYBD組、GCV組。7個(gè)時(shí)相種7個(gè)12孔板細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%融合，傾掉培養(yǎng)液，4組均接種100 TCI D50攻擊量MCMV Smith株50μl/孔，置37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，病毒吸附2 h，正常細(xì)胞組、病毒感染組換新維持液，JYBD組，棄病毒液，加入TD0JYBD，更GCV組棄病毒液，加入TD0更昔洛韋，均分別作用12、24、72、120 h，收獲細(xì)胞，待檢測(cè)。陰性對(duì)照組操作方法同病毒感染組、JYBD組、GCV組，用0.01 mol/L PBS代替一抗來檢測(cè)HSP70。

1.2.5 HSP70檢測(cè)采用免疫組化法：每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。

1.2.6 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 圖像分析：采用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)特異性 每次試驗(yàn)陰性對(duì)照均呈陰性結(jié)果(細(xì)胞內(nèi)未見陽性著色)，陽性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色陽性信號(hào)，說明實(shí)驗(yàn)特異性良好。

2.2 細(xì)胞病變情況 病毒感染組：MCMV感染12 h，HSP70表達(dá)開始增高時(shí)，25%細(xì)胞胞漿發(fā)生較明顯的空泡變性;感染24 h，HSP70繼續(xù)升高時(shí)，50%左右胞漿發(fā)生明顯的空泡變性，感染72 h HSP70表達(dá)繼續(xù)升高，75%空泡變性以胞核周圍為主;感染120 h，HSP70表達(dá)達(dá)高峰時(shí)，85%細(xì)胞出現(xiàn)病變，部分細(xì)胞變圓腫脹，發(fā)生病變變圓細(xì)胞出現(xiàn)萎縮改變，部分形態(tài)正常細(xì)胞胞漿出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡變性。說明MCMV感染時(shí)，HSP70的表達(dá)強(qiáng)度與細(xì)胞病變程度相關(guān)。與病毒感染組比較，JYBD組：12～72 h細(xì)胞胞漿空泡變性程度均減輕，未觀察到病變變圓細(xì)胞，120 h觀察到出現(xiàn)病變變圓細(xì)胞，而部分正常細(xì)胞胞漿空泡變性程度減輕。與JYBD組比較，GCV組細(xì)胞胞漿空泡變性程度與之相當(dāng)，但120 h未觀察到病變變圓細(xì)胞。見圖1～4，表 1。

表1 不同處理組細(xì)胞病變的程度

圖1 正常的小鼠胚肺細(xì)胞(正?！?00)

圖2 MCMV感染小鼠胚肺細(xì)胞出現(xiàn)50%病變(正?！?00)

圖3 免疫組化檢測(cè)加入金葉敗毒120h熱休克蛋白70表達(dá)情況(免疫組化×200)

圖4 免疫組化檢測(cè)加入更昔洛韋120h熱休克蛋白70表達(dá)情況(免疫組化×200)

2.3 陽性信號(hào)在細(xì)胞各部位表達(dá)情況 正常細(xì)胞對(duì)照組：較多細(xì)胞核內(nèi)為淡棕色細(xì)顆粒，個(gè)別細(xì)胞核周圍、胞漿可見淡棕色陽性信號(hào)。核內(nèi)為淡棕色細(xì)顆粒，個(gè)別細(xì)胞核周圍、胞漿可見淡棕色陽性信號(hào)。病毒感染組：感染12 h細(xì)胞漿核表達(dá);感染24 h主要在細(xì)胞核周圍表達(dá);感染72 h主要在胞核表達(dá)，以病變細(xì)胞為主;感染120 h病變細(xì)胞內(nèi)均有大量HSP70表達(dá)。JYBD組：12 h HSP70主要在胞核內(nèi)表達(dá)，24 h主要在細(xì)胞核周圍表達(dá)，72 h在細(xì)胞核、漿內(nèi)表達(dá)，120 h主要在細(xì)胞漿、核周表達(dá)。GCV組：12 h主要在細(xì)胞漿表達(dá)，24 h主要在細(xì)胞核周圍表達(dá)，72 h主要在細(xì)胞核表達(dá)，120 h在細(xì)胞核周圍表達(dá)。

2.4 HSP70各時(shí)相表達(dá)強(qiáng)度 病毒感染組：12 h開始上升，72 h繼續(xù)上升，120 h達(dá)高峰。與正常細(xì)胞組比較，各時(shí)相HSP70表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。JYBD組：12 h HSP70表達(dá)增強(qiáng)，24 h稍降低，72 h變?yōu)橹饾u上升，120 h達(dá)最高點(diǎn)。與正常細(xì)胞組比較，各時(shí)相HSP70表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與病毒組比較，12、24 h HSP70表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GCV組：12 h HSP70表達(dá)增強(qiáng)，24 h表達(dá)最低，72～120 h變?yōu)橹饾u升高，與正常細(xì)胞組比較，各時(shí)相HSP70表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＜0.05);與病毒組比較，12、24 h 2個(gè)時(shí)相HSP70表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與JYBD組比較，各時(shí)相HSP70表達(dá)強(qiáng)度差異均異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 不同處理組HSP70表達(dá)強(qiáng)度±s

表2 不同處理組HSP70表達(dá)強(qiáng)度±s

注：與正常細(xì)胞組比較，*P＜0.05;與病毒感染組比較，#P＜0.05

12 0.0607±0.0030 0.1597±0.0147* 0.2393±0.0171*#0.2294±0.0303*#24 0.0606±0.0005 0.1204±0.0202* 0.1422±0.0059*#0.1592±0.0239*#72 0.0642±0.0041 0.1865±0.0273* 0.1867±0.0489* 0.23538±0.02088*120 0.0628±0.0031 0.3135±0.0443* 0.2527±0.0367* 0.24972±0.02664*

3 討論

3.1 探討金葉敗毒抗MCMV感染價(jià)值 目前，HCMV感染非常普遍，孕婦易發(fā)生活動(dòng)性感染導(dǎo)致宮內(nèi)傳播，HCMV宮內(nèi)感染可以導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、感音神經(jīng)性耳聾、認(rèn)知障礙、出生后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后等不良后果［5-7］。GCV具有良好的抗HCMV作用，但孕期使用可能引起胎兒唇裂、無眼或小眼癥等［8-10］，孕婦禁用。因此，目前臨床尚無治療孕期HCMV活動(dòng)性感染的藥物。JYBD是一種純中藥制劑，它的四種成分金銀花、魚腥草、大青葉、蒲公英是祖國醫(yī)學(xué)常見清熱解毒藥物，已證實(shí)：該藥具有抗HCMV和豚鼠巨細(xì)胞病毒作用且生殖毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性［4］，故有望成為治療孕期HCMV感染藥物。

3.2 JYBD對(duì)MCMV感染細(xì)胞的細(xì)胞病變影響 本實(shí)驗(yàn)顯示，與病毒感染組比較，JYBD組：12～72 h細(xì)胞胞漿空泡變性程度均減輕，未觀察到病變變圓細(xì)胞，120 h觀察到出現(xiàn)病變變圓細(xì)胞，可能與JYBD作用逐漸減弱有關(guān)，而部分正常細(xì)胞胞漿空泡變性程度減輕。與JYBD組比較，GCV組細(xì)胞胞漿空泡變性程度與之相當(dāng)，但120 h未觀察到病變變圓細(xì)胞，表明，GCV比JYBD持續(xù)作用更長(zhǎng)，對(duì)MCMV感染抑制時(shí)間更長(zhǎng)，由此推測(cè)，二者對(duì)MCMV感染均有抑制作用。

3.3 JYBD對(duì)MCMV感染細(xì)胞HSP70表達(dá)影響 從細(xì)胞病變程度來看，與病毒組比較，金葉敗毒組由于HSP70在胞核內(nèi)出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，表達(dá)水平高，細(xì)胞病變程度減輕，但當(dāng)HSP70表達(dá)水平下降后(120 h)出現(xiàn)細(xì)胞病變，從HSP70表達(dá)強(qiáng)度分析，與病毒對(duì)照組比較，加入金葉敗毒和GCV，HSP70表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步增高，其中，12～24 h表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于病毒感染組，但72 h后增強(qiáng)作用減弱。從HSP70核漿移位現(xiàn)象看，與病毒組比較，金葉敗毒組HSP70核漿移位現(xiàn)象提前，12 h HSP70已明顯進(jìn)入細(xì)胞核，且在細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，(病毒組12 h主要在細(xì)胞漿)，120 h部分正常細(xì)胞HSP70已移位至細(xì)胞漿、胞核周圍，病變細(xì)胞在胞核表達(dá)。與金葉敗毒組比較，GCV組HSP70在細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)時(shí)間短。

上述結(jié)果提示，JYBD通過影響HSP70表達(dá)來抑制MCMV致細(xì)胞病變作用，提示，JYBD增強(qiáng)病毒感染細(xì)胞中HSP70表達(dá)，可能是其抗MCMV分子機(jī)制。

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