高文娟

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是慢性胃炎的主要病因，已被世界衛(wèi)生組織列為胃癌的Ⅰ類致癌危險因素［1］。胃癌的發(fā)生是一個多階段漸進(jìn)的過程，H.pylori在正常胃黏膜向癌前病變和胃癌轉(zhuǎn)化過程中對細(xì)胞生長的影響如何尚不明確。轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor beta，TGF-β)是重要的細(xì)胞生長調(diào)控成分，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。我們先前的研究已發(fā)現(xiàn)，在慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)組織和重度腸化生(intestinal metaplasia，IM)胃黏膜組織中，H.pylori感染與TGF-β1表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，而胃黏膜中重度不典型增生(dysplasia，Dys)組織及胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GAC)組織中則沒有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性，提示H.pylori對TGF-β1的影響可能主要作用于胃癌發(fā)生的早期［2］。在此基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為研究H.pylori相關(guān)性胃炎及伴有癌前病變的胃黏膜對了解H.pylori與TGF-β1的關(guān)系更為重要。TGF-β受體是介導(dǎo)TGF-β作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，有關(guān)H.pylori感染與TGF-βRI表達(dá)水平的關(guān)系尚未受到重視。本文采用H.pylori快速尿素酶試驗(HpRUT)、PCR-Hp-16SrRNA檢測和14C-尿素呼氣試驗(14C-UBT)同步檢測CSG、重度IM和中重度Dys組織中H.pylori感染情況，并以免疫組化方法分別檢測其中TGF-βRI的表達(dá)，探討H.pylori感染對TGF-βRI表達(dá)的影響及對胃癌發(fā)生過程的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2008年2月至2009年4月間胃鏡活檢標(biāo)本，篩選108例進(jìn)入研究。其中CSG49例(CSG組，H.pylori陰性的輕度CSG 16例;H.pylori相關(guān)性CSG 33例)，重度IM 39例(IM組)，中重度不典型增生20例(Dys組)(中度13例，重度7例)。所有標(biāo)本在胃竇距幽門3 cm以內(nèi)取2塊胃黏膜組織，1塊即行HpRUT，1塊-7℃保存，備PCR檢測。另各取病灶胃黏膜組織2塊，100 ml/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。

1.2 方法

1.2.1 H.pylori檢測

1.2.1.1 Hp-RUT:采用HpUT-H104試劑盒(分析化學(xué)法，福建三強(qiáng)生化有限公司)，5 min以內(nèi)呈黃至棕黃色為陽性，不變色為陰性。

1.2.1.2 PCR-Hp-16SrRNA檢測:采用PE9600PCR儀(Perkin-Elmer公司)，PCR-Hp-16SrRNA 引物序列 CP-1:5’-GCG CAA TCA GCG TCA GGT AAT G-3’，CP-2:5’-GCT AAG AGA TCA GCCTAT GTCC-3’，擴(kuò)增片段500 bp，產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下呈與陽性對照相同位置的明顯條帶為陽性。

1.2.1.3 14C-UBT:患者在檢查前4周內(nèi)未服用抗H.pylori藥物，以100 dpm/mmol CO2為診斷閾值，大于診斷閾值判為H.pylori陽性。

1.2.2 H.pylori診斷標(biāo)準(zhǔn):Hp-RUT、PCR-Hp-DNA和14C-UBT 3項檢測中2項以上陽性者判為H.pylori陽性;均陰性判為H.pylori陰性，僅1項陽性者未進(jìn)入本研究。

1.2.3 免疫組化染色結(jié)果判斷:按A:無染色為0分，細(xì)胞膜或漿內(nèi)見淡黃色顆粒、明顯高于背景為1分，較多棕黃色顆粒為2分，大量深棕黃色顆粒為3分;B:每片隨機(jī)觀察5個視野，計數(shù)500個細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)＜30%為1分，31%～75%2分，＞76%為3分。A×B得0者為-，1～4分為+，4分以上++。

1.2.4 TGF-βRI檢測:采用免疫組化 SP 法，即用型 TGF-βRI抗體及SP試劑盒，PBS代替一抗為陰性對照，室溫下操作:①切片脫蠟至水;②每步用PBS工作液洗3次，每次3 min;③過氧化酶阻斷劑10 min;④10%非免疫血清孵育10 min;⑤第一抗體孵育60 min;⑥生物素標(biāo)記的第二抗體孵育10 min;⑦鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶孵育10 min;⑧DAB顯色;⑨蘇木素復(fù)染、中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗、spearman等級相關(guān)分析及Kolmogorov-Smirnov檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori感染情況 CSG組67.35%(33/49)H.pylori陽性，IM組為82.05%(32/39)，Dys組為60%(12/20)。其中中度Dys組為53.85%(7/13)，重度 Dys組為71.43%(5/7)。3組H.pylori陽性率無顯著性差異(χ2=3.825，P=0.148)。見表1。

表1 3組H.pylori感染情況 例

2.2 TGF-βRⅠ表達(dá)與H.pylori感染 TGF-βRⅠ陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈深棕色，分布于胞膜及胞質(zhì)。等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，從CSG、IM到中度、重度Dys組，各組中H.pylori陽性者TGF-βRI的表達(dá)與病變的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.707，P＜0.01)，隨黏膜病變程度的加重，TGF-βRI表達(dá)呈減少趨勢;而各組中H.pylori陰性者無1例TGF-βRI表達(dá)缺失，Kolmogorov-Smirnov檢驗示4組H.pylori陰性者TGF-βRI表達(dá)無顯著差異(Kolmogorov-Smirnov Z=1.162，P=0.134)。見表2、3。

表2 4組中H.pylori陽性者TGF-βRI表達(dá)情況 例

表3 4組中Hp陰性者TGF-βRI表達(dá)情況 例

3 討論

目前公認(rèn)H.pylori持續(xù)感染可引起慢性胃炎，進(jìn)而引起胃黏膜細(xì)胞代謝改變，阻斷胃液中抗壞血酸的主動分泌機(jī)制，當(dāng)H.pylori感染慢性胃炎發(fā)展至萎縮和腸化時，胃酸分泌減少，胃內(nèi)pH升高，不但降低了胃中和環(huán)境致癌原的能力，而且有利于細(xì)菌繁殖，并促進(jìn)N-亞硝基化合物的形成，從而有利于胃癌的發(fā)生。在這一過程中，H.pylori對胃黏膜上皮細(xì)胞增殖調(diào)控的影響機(jī)制十分復(fù)雜。我們的研究曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，H.pylori陽性的IM及Dys胃黏膜組織中，PCNA高表達(dá)者顯著多于H.pylori陰性組，提示H.pylori感染確可增加胃黏膜細(xì)胞的增殖，同時發(fā)現(xiàn)在GAC組中PCNA的表達(dá)與H.pylori的感染情況無關(guān)，這可能提示H.pylori主要作用于胃癌發(fā)生的早期［3］。

TGF-β家族是一類多功能的細(xì)胞因子，哺乳動物表達(dá)其中的 TGF-β1，2，3。TGF-β 家族有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受體，其中Ⅲ型受體不直接傳遞信號，TGF-β的信號是通過Ⅰ、Ⅱ型受體與TGF-β配體形成復(fù)合物，活化Ⅰ型受體的STK激酶而傳遞到胞內(nèi)。TGF-β及其受體的功能是影響細(xì)胞生長調(diào)控的重要因素，參與了胃癌的發(fā)生［4］。我們率先對H.pylori與TGF-β1表達(dá)進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染可上調(diào)胃黏膜TGF-β1的表達(dá)，但這一作用主要出現(xiàn)在癌前病變組織［2］。于TGF-β1的表達(dá)存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，TGF-β1的高表達(dá)可能與組織獲得產(chǎn)生TGF-β1的能力有關(guān)。作為致癌危險因子的H.pylori感染是否通過影響TGF-β受體在胃黏膜癌前病變的表達(dá)進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生，應(yīng)是了解H.pylori在胃癌發(fā)生過程中作用的一個重要內(nèi)容。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在H.pylori陽性的病例，從CSG、IM到中度、重度Dys組，隨黏膜病變程度的加重，TGF-βRI表達(dá)呈減少趨勢，病變程度與TGF-βRI表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，H.pylori感染明顯下調(diào)了TGF-βRI的表達(dá)，這種情況下，高水平的TGF-β1可能對自身無抑制效應(yīng)，但可抑制周圍組織的增殖和淋巴細(xì)胞的免疫作用，從而有利于腫瘤的生長。大量的TGF-β1一方面可減輕機(jī)體產(chǎn)生的炎性反應(yīng)，另一方面可能通過抑制TH1型和增強(qiáng)TH2型的免疫應(yīng)答調(diào)低免疫反應(yīng)，導(dǎo)致H.pylori感染慢性化［5］。H.pylori持續(xù)感染不但可誘導(dǎo)有絲分裂，且慢性炎癥過程中DNA鏈斷裂和染色體損傷的積累，有利于內(nèi)源性突變發(fā)生［6］。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)各組中H.pylori陰性者無1例TGF-βRⅠ表達(dá)缺失，且其TGF-βRI表達(dá)無顯著差異。因此我們認(rèn)為，H.pylori感染可能是誘發(fā)胃黏膜癌前病變組織TGF-βRⅠ表達(dá)缺失，進(jìn)而逃避TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，喪失胃黏膜高增殖狀態(tài)下DNA復(fù)制的精密性，從而向癌變演化過程的又一個重要影響因素。

1 朱亞杰，邱萌，周繼陶，等.胃癌中 P53蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的分析及其臨床意義.中華醫(yī)學(xué)遺傳雜志，2010，27:60-65.

2 Gu YM，Ma YH，Zhao WG，et al.Dickkopf3 overexpressioninhibits pancreatic cancer cell growth in vitro.World JGastroenterol，2011，17:3810-3817.

3 Tsai KW，Wu CW，Hu LY，et al.Epigenetic regulation of miR-34b and miR-129 expression in gastric cancer.Int J Cancer，2011，129:2600-2610.

4 Ding WJ，F(xiàn)ang JY，Chen XY，et al.The expression and clinicalsignificance of DNA methyltransferase proteins in human gastriccancer.Dig Dis Sci，2008，53:2083-2089.

5 Yokobori T，Mimori K，Iwatsuki M，et al.p53-Altered FBXW7 expression determines poor prognosis in gastric Cancer cases.Cancer Res，2009，69:3788-3794.

6 Sirak I，Petera J，Hatlova J，et al.Expression of p53，p21 and p16 does not correlate with responseto preoperative chemoradiation in gastric carcinom.Hepatogastroenterology，2009，56:1213-1218.