金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/h1>
2013-10-09 03:43:34饒力群李夢(mèng)蕓馬珊珊
湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年19期
郭 純 ，楊 華 ，饒力群 ，李夢(mèng)蕓，馬珊珊
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司，湖南 常德 415001）
凍害是農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害的一種。常發(fā)生的有越冬作物凍害、果樹(shù)凍害和經(jīng)濟(jì)林木凍害等[1-3]。凍害對(duì)農(nóng)業(yè)威脅很大，如美國(guó)的柑橘生產(chǎn)、中國(guó)的冬小麥和柑橘生產(chǎn)常因凍害而遭受巨大損失。歷史上，我國(guó)長(zhǎng)江流域、美國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)就因嚴(yán)重的周期性凍害數(shù)次遭受嚴(yán)重打擊。自1949年以來(lái)，我國(guó)出現(xiàn)了5次柑橘大凍害（1955年，1969年，1977年，1992年和2008年），僅1992年1月的凍害使我國(guó)柑橘受凍面積達(dá)56萬(wàn)hm2，產(chǎn)量損失超過(guò)200萬(wàn)t；2008年1～2月的冰凍對(duì)幾個(gè)主要產(chǎn)區(qū)均造成嚴(yán)重影響，特別是湖南、湖北等地更為嚴(yán)重。湖北的三峽庫(kù)區(qū)、丹江庫(kù)區(qū)、富水庫(kù)區(qū)等柑橘集中產(chǎn)區(qū)75%以上的柑橘受到不同程度的凍害，其中有25%的柑橘受到毀滅性損害。湘西的柑橘產(chǎn)業(yè)也遭到了毀滅性打擊，受災(zāi)面積達(dá)6.67萬(wàn)hm2，成災(zāi)4.73萬(wàn)hm2，絕收近1.93萬(wàn)hm2，直接經(jīng)濟(jì)損失約7億元。面對(duì)如此頻繁的災(zāi)害影響，研究柑橘抗凍的機(jī)制顯得十分必要，而建立柑橘抗凍試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣t是研究柑橘抗凍機(jī)制的前提條件。試驗(yàn)采用冷馴化誘發(fā)抗寒能力的金柑為實(shí)驗(yàn)組[4]，以未冷馴化誘發(fā)抗寒能力的金柑為對(duì)照組，模擬柑橘越冬時(shí)氣溫低、土溫高的環(huán)境[5-6]，摸索金柑能耐受的最低溫度和低溫持續(xù)時(shí)間，以建立金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
挑選生長(zhǎng)健壯、粗細(xì)較一致的2 a生金柑（Fortunella margarita(Lour.)Swingle）苗 200株，用缽高24 cm、缽開(kāi)口直徑為24 cm規(guī)格的營(yíng)養(yǎng)缽栽植，營(yíng)養(yǎng)土為菜園土摻1/3的火土灰，采用一般的肥水管理和病蟲(chóng)害防治。所有材料放置室溫28℃（室內(nèi)溫度變動(dòng)26.5℃～29.5℃。）正常生長(zhǎng)1個(gè)月后，隨機(jī)選取100株移入控溫室內(nèi)進(jìn)行冷馴化，溫度設(shè)定為4℃，室內(nèi)溫度為3.5～6.0℃，時(shí)間15 d。
1.2 低溫處理
試驗(yàn)材料在冷馴化半個(gè)月后，每3株用棉絮包裹營(yíng)養(yǎng)袋及根頸，放入試驗(yàn)改裝的控溫箱進(jìn)行低溫處理。控溫箱溫度在0～-20℃（溫度變化控制在±0.2℃）。以未冷馴化的金柑經(jīng)過(guò)不同時(shí)間不同溫度的低溫處理后作為對(duì)照，取樣進(jìn)行生理生化分析，單株設(shè)3次重復(fù)。
1.3 細(xì)胞損傷分析
金柑受凍的葉片表現(xiàn)為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質(zhì)感變薄，葉片上的細(xì)小白點(diǎn)消失，數(shù)小時(shí)后逐漸卷曲，2~3 d后葉片干枯。以成熟葉片是否凍死（處理后葉片卷曲、干枯）為標(biāo)準(zhǔn)，配合電解質(zhì)滲出率及丙二醛（MDA）含量的測(cè)定，找到金柑在試驗(yàn)條件下所能耐受的最低溫度及能耐受低溫的持續(xù)時(shí)間。
1.3.1 電解質(zhì)滲出率的測(cè)定 經(jīng)低溫處理的材料分別放入20 mL具塞刻度試管中，準(zhǔn)確加入去離子水20 mL，蓋上試管塞，在控溫室浸泡24 h，每次浸泡時(shí)保持環(huán)境溫度基本一致，攪動(dòng)混勻后用精密電導(dǎo)率儀（DDS-312型，上海大普儀器有限公司）測(cè)定溶液電導(dǎo)率，冷馴化處理樣品的電導(dǎo)率為E1，對(duì)照材料的電導(dǎo)率為E0。冷馴化處理的樣品再放入98±2℃沸水浴中1 h，以殺死植物組織，取出置控溫室冷卻至室溫，測(cè)其煮沸電導(dǎo)率E2，按下式計(jì)算各處理的電解質(zhì)滲出率：電解質(zhì)滲出率（%）=[（E1-E0）/（E2-E0）]×100%。
1.3.2 丙二醛（MD A）含量的測(cè)定 取待測(cè)液1.0 mL，加入 5.0 mL 20%的三氯乙酸（TCA）（含 0.5%的硫代巴比妥酸：TBA）混勻后塞上塞子，水浴煮沸30 min，冰浴快速冷卻，4 000 r/min 離心 10 min，以20%TCA為參照，上清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定532 nm和600 nm處的吸光值A(chǔ)532和A600，重復(fù)3次求平均值，MDA含量=△A×N/W。△A=A532-A600，N為稀釋倍數(shù)，W為植物樣品重量（g）。
2 結(jié)果與分析
2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鎏幚頃r(shí)間
為了探討金柑生長(zhǎng)期所能耐受的冰凍低溫持續(xù)時(shí)間，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在-6℃下處理不同時(shí)間，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗冰凍30 min均未表現(xiàn)出凍害癥狀；未經(jīng)冷馴化的金柑冰凍40 min出現(xiàn)凍害癥狀，60 min其大多數(shù)葉片受凍；而經(jīng)冷馴化的金柑冰凍50 min才出現(xiàn)凍害癥狀，60 min只是輕微的凍害（表1）。為減少控溫箱中缺乏光照的影響，并鑒于上述結(jié)果，選定抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鎏幚頃r(shí)間為60 min。
表1 -6℃下不同時(shí)間處理金柑葉片受凍情況
2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鎏幚頊囟?/h3>
為了探討金柑生長(zhǎng)期所能耐受的致死溫度，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在不同溫度下冰凍處理60 min，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗0℃下均未表現(xiàn)出凍害癥狀；未經(jīng)冷馴化的金柑-3℃出現(xiàn)凍害癥狀、-6℃大多數(shù)葉片受凍、-12℃全部葉片受凍；而經(jīng)冷馴化的金柑-6℃才出現(xiàn)輕微的凍害癥狀、-12℃大多數(shù)葉片受凍（表2）?？紤]到抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭形唇?jīng)冷馴化的對(duì)照組要求表現(xiàn)受凍，而經(jīng)冷馴化的處理組不能表現(xiàn)受凍，因此抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鰷囟刃枰x定在-9～-12℃。
2.3 低溫脅迫對(duì)金柑葉片電解質(zhì)滲出率的影響
表2 不同低溫處理60 min金柑葉片受凍情況
兩種預(yù)處理的金柑在溫度高于-6℃條件下冰凍60 min，其葉片電解質(zhì)滲出率均低于50%；但未經(jīng)過(guò)冷馴化的金柑在-9℃條件下冰凍處理，其葉片電解質(zhì)滲出率增加到58.4%，當(dāng)溫度下降到-12℃時(shí)，電解質(zhì)滲出率陡然增加到96.2%，表現(xiàn)為所有葉片均嚴(yán)重受損；而經(jīng)過(guò)冷馴化的金柑葉片電解質(zhì)滲出率在-9℃條件下依然低于50%，當(dāng)溫度下降到-12℃時(shí)，電解質(zhì)滲出率平緩地增加到51.4%，表現(xiàn)為部分葉片受損（圖1）。將溫度-電解質(zhì)滲出率擬合Logistic方程[7-8]，可以求出半致死溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)冷馴化的金柑的半致死溫度低于-10℃。當(dāng)溫度處于-10℃時(shí)，未經(jīng)冷馴化的對(duì)照組受凍60 min，其葉片的電解質(zhì)滲出率遠(yuǎn)大于50%，表現(xiàn)出嚴(yán)重的凍害，可以作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?duì)照組；當(dāng)溫度處于-10℃時(shí)，經(jīng)冷馴化的實(shí)驗(yàn)組受凍60 min，其葉片的電解質(zhì)滲出率低于50%，不會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的凍害，可以作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)組。
2.4 低溫脅迫對(duì)金柑葉片中丙二醛（MDA）含量的影響
MDA是膜質(zhì)受氧自由基破壞的產(chǎn)物，是膜損傷的重要指示指標(biāo)。隨著溫度的降低，凍害加深，MDA含量也逐步增加。到-9℃時(shí)處理60 min出現(xiàn)峰值，但到-12℃時(shí)MDA含量反而急劇降低。對(duì)照組在-12℃時(shí)處理60 min的MDA含量較-9℃時(shí)處理60 min的MDA含量下降了0.062 6，處理組下降了 0.084 6（圖 2）。
2.5 抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臋z驗(yàn)
圖2 不同冰凍溫度處理下金柑葉片MDA含量的變化
根據(jù)對(duì)不同溫度和不同處理時(shí)間的研究，選定處理溫度為-9～-12℃之間，處理時(shí)間為60 min。再通過(guò)考察金柑葉片電解質(zhì)滲出率和MDA含量，選定處理溫度為-10℃。對(duì)照組和冷馴化組金柑經(jīng)過(guò)-10℃條件下冰凍60 min處理，結(jié)果如圖3。研究結(jié)果表明：未經(jīng)冷馴化的對(duì)照組在-10℃條件下冰凍60 min后受到嚴(yán)重凍傷。葉片表現(xiàn)為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質(zhì)感變薄，葉片上的細(xì)小白點(diǎn)消失，1 h后逐漸卷曲，2~3 d干枯，樹(shù)枝變軟、下垂，逐步變黃，數(shù)日后干枯，最后整株死亡；經(jīng)過(guò)冷馴化的處理組在-10℃條件下冰凍60 min后受到一定的凍害。葉片呈輕微水漬狀，顏色加深呈淺綠色，葉片上的部分細(xì)小白點(diǎn)消失，少部分嫩葉微卷曲；嫩枝變軟，葉片下垂；經(jīng)過(guò)28℃恢復(fù)1星期，葉色變淺，葉片背面呈白色，細(xì)小白點(diǎn)重新出現(xiàn)，嫩枝變硬，葉片抬升；并有少數(shù)腋芽萌動(dòng)。由此表明：在-10℃條件下冰凍60 min，對(duì)照組受到嚴(yán)重凍害，而處理組只有輕微凍害并能得到恢復(fù)。因此，-10℃可以作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶幚頊囟取?/p>
圖3 -10℃條件下60 min冰凍處理金柑葉片受凍情況
3 討論
3.1 材料的選擇
柑橘的耐寒性與柑橘品種密切相關(guān)，柑橘品種的耐寒能力依次為：枳>金柑>闊皮柑橘>酸橙>甜橙>柚類>檸檬、枸櫞[9-10]。枳耐寒能力最強(qiáng)，但枳到冬天葉片會(huì)脫落，無(wú)法用其葉片開(kāi)展抗凍研究[11]。金柑，又名金桔，屬蕓香科，是著名的觀果植物。金柑雖然抗寒能力弱于枳，但其屬常綠植物，而且葉形較大，取材方便，是開(kāi)展柑橘抗凍研究的理想材料。
3.2 金柑根系的保護(hù)
柑橘根系不耐低溫，在自然條件下，柑橘越冬時(shí)氣溫雖然低，但根際土壤的溫度仍較高，使根系不受低溫影響。但在實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于盆栽苗土壤少，冰凍處理時(shí)無(wú)法維持較高溫度，柑橘根系受損，影響抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅰＲ虼?，試?yàn)采用棉絮包裹營(yíng)養(yǎng)缽及根頸的辦法保護(hù)金柑根系。
3.3 處理時(shí)間和溫度的選擇
試驗(yàn)結(jié)果表明，冰凍處理時(shí)間60 min的效果和70 min的效果相當(dāng)。由于控溫箱中缺乏光照，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，金柑將受到影響，因此選定處理時(shí)間為60 min。
柑橘凍害的氣象指標(biāo)，按凍害的發(fā)生程度可分為-5℃、-7℃、-9℃、-11℃等 4個(gè)溫度等級(jí)，分別代表柑橘開(kāi)始受凍害、輕凍害、凍害和重凍害的指標(biāo)。但以往的研究表明，冷凍室冰凍處理與自然界冰凍有差異。因此，根據(jù)前期的研究，將溫度設(shè)置為0℃、-3℃、-6℃、-9℃和-12℃。
3.4 金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>
以冷馴化后冰凍處理未表現(xiàn)凍害的金柑為抗凍組，以未冷馴化后冰凍處理表現(xiàn)凍害的金柑為對(duì)照組建立金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。研究結(jié)果表明：金柑在-10℃條件下冰凍60 min后，對(duì)照組受到嚴(yán)重凍害，而經(jīng)過(guò)冷馴化的處理組只有輕微凍害并能得到恢復(fù)。因此，-10℃可作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶幚頊囟取?/p>
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凍害是農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害的一種。常發(fā)生的有越冬作物凍害、果樹(shù)凍害和經(jīng)濟(jì)林木凍害等[1-3]。凍害對(duì)農(nóng)業(yè)威脅很大，如美國(guó)的柑橘生產(chǎn)、中國(guó)的冬小麥和柑橘生產(chǎn)常因凍害而遭受巨大損失。歷史上，我國(guó)長(zhǎng)江流域、美國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)就因嚴(yán)重的周期性凍害數(shù)次遭受嚴(yán)重打擊。自1949年以來(lái)，我國(guó)出現(xiàn)了5次柑橘大凍害（1955年，1969年，1977年，1992年和2008年），僅1992年1月的凍害使我國(guó)柑橘受凍面積達(dá)56萬(wàn)hm2，產(chǎn)量損失超過(guò)200萬(wàn)t；2008年1～2月的冰凍對(duì)幾個(gè)主要產(chǎn)區(qū)均造成嚴(yán)重影響，特別是湖南、湖北等地更為嚴(yán)重。湖北的三峽庫(kù)區(qū)、丹江庫(kù)區(qū)、富水庫(kù)區(qū)等柑橘集中產(chǎn)區(qū)75%以上的柑橘受到不同程度的凍害，其中有25%的柑橘受到毀滅性損害。湘西的柑橘產(chǎn)業(yè)也遭到了毀滅性打擊，受災(zāi)面積達(dá)6.67萬(wàn)hm2，成災(zāi)4.73萬(wàn)hm2，絕收近1.93萬(wàn)hm2，直接經(jīng)濟(jì)損失約7億元。面對(duì)如此頻繁的災(zāi)害影響，研究柑橘抗凍的機(jī)制顯得十分必要，而建立柑橘抗凍試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣t是研究柑橘抗凍機(jī)制的前提條件。試驗(yàn)采用冷馴化誘發(fā)抗寒能力的金柑為實(shí)驗(yàn)組[4]，以未冷馴化誘發(fā)抗寒能力的金柑為對(duì)照組，模擬柑橘越冬時(shí)氣溫低、土溫高的環(huán)境[5-6]，摸索金柑能耐受的最低溫度和低溫持續(xù)時(shí)間，以建立金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
挑選生長(zhǎng)健壯、粗細(xì)較一致的2 a生金柑（Fortunella margarita(Lour.)Swingle）苗 200株，用缽高24 cm、缽開(kāi)口直徑為24 cm規(guī)格的營(yíng)養(yǎng)缽栽植，營(yíng)養(yǎng)土為菜園土摻1/3的火土灰，采用一般的肥水管理和病蟲(chóng)害防治。所有材料放置室溫28℃（室內(nèi)溫度變動(dòng)26.5℃～29.5℃。）正常生長(zhǎng)1個(gè)月后，隨機(jī)選取100株移入控溫室內(nèi)進(jìn)行冷馴化，溫度設(shè)定為4℃，室內(nèi)溫度為3.5～6.0℃，時(shí)間15 d。
1.2 低溫處理
試驗(yàn)材料在冷馴化半個(gè)月后，每3株用棉絮包裹營(yíng)養(yǎng)袋及根頸，放入試驗(yàn)改裝的控溫箱進(jìn)行低溫處理。控溫箱溫度在0～-20℃（溫度變化控制在±0.2℃）。以未冷馴化的金柑經(jīng)過(guò)不同時(shí)間不同溫度的低溫處理后作為對(duì)照，取樣進(jìn)行生理生化分析，單株設(shè)3次重復(fù)。
1.3 細(xì)胞損傷分析
金柑受凍的葉片表現(xiàn)為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質(zhì)感變薄，葉片上的細(xì)小白點(diǎn)消失，數(shù)小時(shí)后逐漸卷曲，2~3 d后葉片干枯。以成熟葉片是否凍死（處理后葉片卷曲、干枯）為標(biāo)準(zhǔn)，配合電解質(zhì)滲出率及丙二醛（MDA）含量的測(cè)定，找到金柑在試驗(yàn)條件下所能耐受的最低溫度及能耐受低溫的持續(xù)時(shí)間。
1.3.1 電解質(zhì)滲出率的測(cè)定 經(jīng)低溫處理的材料分別放入20 mL具塞刻度試管中，準(zhǔn)確加入去離子水20 mL，蓋上試管塞，在控溫室浸泡24 h，每次浸泡時(shí)保持環(huán)境溫度基本一致，攪動(dòng)混勻后用精密電導(dǎo)率儀（DDS-312型，上海大普儀器有限公司）測(cè)定溶液電導(dǎo)率，冷馴化處理樣品的電導(dǎo)率為E1，對(duì)照材料的電導(dǎo)率為E0。冷馴化處理的樣品再放入98±2℃沸水浴中1 h，以殺死植物組織，取出置控溫室冷卻至室溫，測(cè)其煮沸電導(dǎo)率E2，按下式計(jì)算各處理的電解質(zhì)滲出率：電解質(zhì)滲出率（%）=[（E1-E0）/（E2-E0）]×100%。
1.3.2 丙二醛（MD A）含量的測(cè)定 取待測(cè)液1.0 mL，加入 5.0 mL 20%的三氯乙酸（TCA）（含 0.5%的硫代巴比妥酸：TBA）混勻后塞上塞子，水浴煮沸30 min，冰浴快速冷卻，4 000 r/min 離心 10 min，以20%TCA為參照，上清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定532 nm和600 nm處的吸光值A(chǔ)532和A600，重復(fù)3次求平均值，MDA含量=△A×N/W。△A=A532-A600，N為稀釋倍數(shù)，W為植物樣品重量（g）。
2 結(jié)果與分析
2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鎏幚頃r(shí)間
為了探討金柑生長(zhǎng)期所能耐受的冰凍低溫持續(xù)時(shí)間，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在-6℃下處理不同時(shí)間，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗冰凍30 min均未表現(xiàn)出凍害癥狀；未經(jīng)冷馴化的金柑冰凍40 min出現(xiàn)凍害癥狀，60 min其大多數(shù)葉片受凍；而經(jīng)冷馴化的金柑冰凍50 min才出現(xiàn)凍害癥狀，60 min只是輕微的凍害（表1）。為減少控溫箱中缺乏光照的影響，并鑒于上述結(jié)果，選定抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鎏幚頃r(shí)間為60 min。
表1 -6℃下不同時(shí)間處理金柑葉片受凍情況
2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鎏幚頊囟?/h3>
為了探討金柑生長(zhǎng)期所能耐受的致死溫度，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在不同溫度下冰凍處理60 min，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗0℃下均未表現(xiàn)出凍害癥狀；未經(jīng)冷馴化的金柑-3℃出現(xiàn)凍害癥狀、-6℃大多數(shù)葉片受凍、-12℃全部葉片受凍；而經(jīng)冷馴化的金柑-6℃才出現(xiàn)輕微的凍害癥狀、-12℃大多數(shù)葉片受凍（表2）?？紤]到抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭形唇?jīng)冷馴化的對(duì)照組要求表現(xiàn)受凍，而經(jīng)冷馴化的處理組不能表現(xiàn)受凍，因此抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋鶅鰷囟刃枰x定在-9～-12℃。
2.3 低溫脅迫對(duì)金柑葉片電解質(zhì)滲出率的影響
表2 不同低溫處理60 min金柑葉片受凍情況
兩種預(yù)處理的金柑在溫度高于-6℃條件下冰凍60 min，其葉片電解質(zhì)滲出率均低于50%；但未經(jīng)過(guò)冷馴化的金柑在-9℃條件下冰凍處理，其葉片電解質(zhì)滲出率增加到58.4%，當(dāng)溫度下降到-12℃時(shí)，電解質(zhì)滲出率陡然增加到96.2%，表現(xiàn)為所有葉片均嚴(yán)重受損；而經(jīng)過(guò)冷馴化的金柑葉片電解質(zhì)滲出率在-9℃條件下依然低于50%，當(dāng)溫度下降到-12℃時(shí)，電解質(zhì)滲出率平緩地增加到51.4%，表現(xiàn)為部分葉片受損（圖1）。將溫度-電解質(zhì)滲出率擬合Logistic方程[7-8]，可以求出半致死溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)冷馴化的金柑的半致死溫度低于-10℃。當(dāng)溫度處于-10℃時(shí)，未經(jīng)冷馴化的對(duì)照組受凍60 min，其葉片的電解質(zhì)滲出率遠(yuǎn)大于50%，表現(xiàn)出嚴(yán)重的凍害，可以作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?duì)照組；當(dāng)溫度處于-10℃時(shí)，經(jīng)冷馴化的實(shí)驗(yàn)組受凍60 min，其葉片的電解質(zhì)滲出率低于50%，不會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的凍害，可以作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)組。
2.4 低溫脅迫對(duì)金柑葉片中丙二醛（MDA）含量的影響
MDA是膜質(zhì)受氧自由基破壞的產(chǎn)物，是膜損傷的重要指示指標(biāo)。隨著溫度的降低，凍害加深，MDA含量也逐步增加。到-9℃時(shí)處理60 min出現(xiàn)峰值，但到-12℃時(shí)MDA含量反而急劇降低。對(duì)照組在-12℃時(shí)處理60 min的MDA含量較-9℃時(shí)處理60 min的MDA含量下降了0.062 6，處理組下降了 0.084 6（圖 2）。
2.5 抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臋z驗(yàn)
圖2 不同冰凍溫度處理下金柑葉片MDA含量的變化
根據(jù)對(duì)不同溫度和不同處理時(shí)間的研究，選定處理溫度為-9～-12℃之間，處理時(shí)間為60 min。再通過(guò)考察金柑葉片電解質(zhì)滲出率和MDA含量，選定處理溫度為-10℃。對(duì)照組和冷馴化組金柑經(jīng)過(guò)-10℃條件下冰凍60 min處理，結(jié)果如圖3。研究結(jié)果表明：未經(jīng)冷馴化的對(duì)照組在-10℃條件下冰凍60 min后受到嚴(yán)重凍傷。葉片表現(xiàn)為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質(zhì)感變薄，葉片上的細(xì)小白點(diǎn)消失，1 h后逐漸卷曲，2~3 d干枯，樹(shù)枝變軟、下垂，逐步變黃，數(shù)日后干枯，最后整株死亡；經(jīng)過(guò)冷馴化的處理組在-10℃條件下冰凍60 min后受到一定的凍害。葉片呈輕微水漬狀，顏色加深呈淺綠色，葉片上的部分細(xì)小白點(diǎn)消失，少部分嫩葉微卷曲；嫩枝變軟，葉片下垂；經(jīng)過(guò)28℃恢復(fù)1星期，葉色變淺，葉片背面呈白色，細(xì)小白點(diǎn)重新出現(xiàn)，嫩枝變硬，葉片抬升；并有少數(shù)腋芽萌動(dòng)。由此表明：在-10℃條件下冰凍60 min，對(duì)照組受到嚴(yán)重凍害，而處理組只有輕微凍害并能得到恢復(fù)。因此，-10℃可以作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶幚頊囟取?/p>
圖3 -10℃條件下60 min冰凍處理金柑葉片受凍情況
3 討論
3.1 材料的選擇
柑橘的耐寒性與柑橘品種密切相關(guān)，柑橘品種的耐寒能力依次為：枳>金柑>闊皮柑橘>酸橙>甜橙>柚類>檸檬、枸櫞[9-10]。枳耐寒能力最強(qiáng)，但枳到冬天葉片會(huì)脫落，無(wú)法用其葉片開(kāi)展抗凍研究[11]。金柑，又名金桔，屬蕓香科，是著名的觀果植物。金柑雖然抗寒能力弱于枳，但其屬常綠植物，而且葉形較大，取材方便，是開(kāi)展柑橘抗凍研究的理想材料。
3.2 金柑根系的保護(hù)
柑橘根系不耐低溫，在自然條件下，柑橘越冬時(shí)氣溫雖然低，但根際土壤的溫度仍較高，使根系不受低溫影響。但在實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于盆栽苗土壤少，冰凍處理時(shí)無(wú)法維持較高溫度，柑橘根系受損，影響抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅰＲ虼?，試?yàn)采用棉絮包裹營(yíng)養(yǎng)缽及根頸的辦法保護(hù)金柑根系。
3.3 處理時(shí)間和溫度的選擇
試驗(yàn)結(jié)果表明，冰凍處理時(shí)間60 min的效果和70 min的效果相當(dāng)。由于控溫箱中缺乏光照，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，金柑將受到影響，因此選定處理時(shí)間為60 min。
柑橘凍害的氣象指標(biāo)，按凍害的發(fā)生程度可分為-5℃、-7℃、-9℃、-11℃等 4個(gè)溫度等級(jí)，分別代表柑橘開(kāi)始受凍害、輕凍害、凍害和重凍害的指標(biāo)。但以往的研究表明，冷凍室冰凍處理與自然界冰凍有差異。因此，根據(jù)前期的研究，將溫度設(shè)置為0℃、-3℃、-6℃、-9℃和-12℃。
3.4 金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>
以冷馴化后冰凍處理未表現(xiàn)凍害的金柑為抗凍組，以未冷馴化后冰凍處理表現(xiàn)凍害的金柑為對(duì)照組建立金柑抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。研究結(jié)果表明：金柑在-10℃條件下冰凍60 min后，對(duì)照組受到嚴(yán)重凍害，而經(jīng)過(guò)冷馴化的處理組只有輕微凍害并能得到恢復(fù)。因此，-10℃可作為抗凍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶幚頊囟取?/p>
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