劉國(guó)平，于晶晶

白細(xì)胞介素10（interlekin-10，IL-10）是已知的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中為數(shù)不多的一種抑制性細(xì)胞因子，主要由Ⅱ型輔助T細(xì)胞分泌產(chǎn)生，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能和抗炎作用，其生物學(xué)效應(yīng)在重癥感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，已有的研究資料顯示IL-10有望成為臨床相關(guān)疾病治療的新選擇[1-3]。本文旨在利用RT-PCR技術(shù)從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆人IL-10的cDNA并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究IL-10基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)特征及其影響因素和探討臨床開展IL-10基因治療相關(guān)疾病的安全性與可行性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 總RNA分離試劑盒、RT-PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取與純化試劑盒，Qiagen公司產(chǎn)品；大腸桿菌 JM109菌株、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 XhoⅠ （C↓TCGAG）與BamHⅠ （G↓GATCC）、DNA相對(duì)分子量Maker，Promega公司產(chǎn)品；真核表達(dá)質(zhì)粒載體 pcDNA4/HisMax A，Invitrogen公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)粉，Gibico公司產(chǎn)品；優(yōu)級(jí)胎牛血清，TBD生物技術(shù)研究中心產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液，北京京科生物技術(shù)公司產(chǎn)品；引物合成由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司完成。其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采用Ficoll密度梯度法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，按2×106/L培養(yǎng)于含DMEM液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，其中含105 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，100 ml/L胎牛血清，20 mg/L ConA，于 50 ml/L CO2、37℃培養(yǎng) 16 h[4]。

1.2.2 總RNA提取 將1.2.1中含單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)液傾入一無RNA酶、無菌的50 ml的離心管中，4℃，1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，按總RNA分離試劑盒說明提取總RNA，取5 μl RNA進(jìn)行5%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射光下觀察18S、28S rRNA帶，確定RNA提取效果。

1.2.3 IL-10 cDNA的合成及擴(kuò)增、純化 根據(jù)GeneBank中Human IL-10全長(zhǎng)開放讀框基因mRNA序列（NM 000572）設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-CTCGGATCCAAGGCATG CACAGCTCAGC-3’（包含起始密碼子和5’修飾限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5’-CTCCTCGAGCCTGA TGTCTCAGTTTCGTA-3’（包含終止密碼子和5’修飾限制性內(nèi)切酶XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。以提取的總RNA為模板，RT-PCR一步法合成并擴(kuò)增IL-10 cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃，30 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨即95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶15 min。PCR條件：起動(dòng) 94℃、5 min，變性 94℃、1 min，退火 52℃、1 min，延伸72℃、1 min，以上共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。5%瓊脂糖凝膠電泳，分析鑒定RT-PCR產(chǎn)物并純化回收。以上按試劑盒說明書進(jìn)行操作

1.2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定分析 37℃下，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ分別消化RT-PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pcDNA4/HisMax A各4 h，消化產(chǎn)物分別進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并純化回收。16℃，T4DNA連接酶作用下反應(yīng)16 h，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109菌種，氨芐青霉素（50 μg/ml）LB平板常規(guī)篩選陽性重組體。接種LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。4℃下，6000 g離心15 min，除凈培養(yǎng)液。按質(zhì)粒提取試劑盒使用說明純化提取重組質(zhì)粒載體。以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及反應(yīng)條件同前，鑒定重組質(zhì)粒的正確性。重組質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHⅠ單酶切和 XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切分析。上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司ABI PRISMTM310型測(cè)序儀對(duì)IL-10 cDNA序列測(cè)定分析。

2 結(jié) 果

2.1 PBMC中總RNA提取及測(cè)定 提取的PBMC總RNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見完整的28S和18S rRNA，條帶清晰，顯示組織中提取的總RNA完整，RNA無明顯降解（圖1）。紫外分光光度計(jì)測(cè)定，提取的總RNA OD260光密度值為0.0892，RNA 含 量 0.18 μg/μl，OD260/OD28=0.0892/0.0487 ≈1.83，以上結(jié)果表明RNA樣品純度滿意。

2.2 RT-PCR結(jié)果 以PBMC總RNA為模板合成的cDNA第一鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析，與DNA Marker比較，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為0.54 kb，與hIL-10基因大小相符合（圖2）。

2.3 重組真核質(zhì)粒限制性酶切分析結(jié)果 重組真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切，電泳可見大小約為5.3 kb和0.54 kb的2條帶，分別與質(zhì)粒載體pcDNA4/HisMax A和RT-PCR產(chǎn)物大小一致。BamHⅠ單酶切后，電泳可見一條帶大小約為5.8 kb。同時(shí)以重組真核表達(dá)質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物與從PBMC總RNA經(jīng)RT-PCR克隆獲得的hIL-10片段大小相符。以上均表明重組克隆成功，hIL-10基因完整插入質(zhì)粒載體pcDNA4/HisMax A中（圖3）。

2.4 DNA序列測(cè)定結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收，限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生粘性末端后，定向克隆入質(zhì)粒載體pcDNA 4HisMax A，重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果證實(shí)克隆的hIL-10基因與GeneBank中所報(bào)道的hIL-10基因序列一致，表明重組質(zhì)粒載體克隆成功。

圖1 PBMC中提取總RNA瓊脂糖電泳結(jié)果

圖2 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

圖3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒酶切電泳分析

3 討 論

白細(xì)胞介素-10是1989年Fiorentino等首先發(fā)現(xiàn)的，因其有抑制多種細(xì)胞因子合成的功能曾被稱之為細(xì)胞因子合成抑制因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生[5]。人IL-10基因定位于第1號(hào)染色體的1q31～1q32區(qū)域，為單拷貝基因，整個(gè)基因含有3.5 kb，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為含1.8 kb的核苷酸序列，其互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）序列中含有一個(gè)編碼178個(gè)氨基酸的開放讀碼框架，但在一般的情況下表達(dá)水平低下，只有在某些特殊情況下或細(xì)胞受刺激后才出現(xiàn)高水平的表達(dá)。已有的研究表明，IL-10的生物學(xué)功能主要是[6-10]：①抑制單核細(xì)胞依賴性Th細(xì)胞的增生，同時(shí)抑制Th1細(xì)胞類細(xì)胞因子如 IL-1、IL-2、INF-γ、TNF-α 等的合成及活性； ②抑制單核細(xì)胞表面MHCⅡ抗原分子HLA-DR/DP及DQ的表達(dá)，降低抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈能力，阻斷抗原特異性的單核、巨噬細(xì)胞因子；③通過抑抑制INF-γ的產(chǎn)生抑NK細(xì)胞的活性。這些生物學(xué)作用符合了臨床部分疾病如重癥感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的治療需要。

基因治療是指將外源基因（目的基因），通過一定載體導(dǎo)入靶細(xì)胞（受體細(xì)胞），以補(bǔ)償靶細(xì)胞的基因缺陷或蛋白分泌水平，或轉(zhuǎn)基因的蛋白產(chǎn)物封閉靶細(xì)胞某種受體，使靶細(xì)胞獲得新的生物學(xué)行為或功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。獲得目的基因，是實(shí)施基因治療從而達(dá)到治療疾病目的的一項(xiàng)重要步驟。目前，獲得目的基因的主要方法有：①真接從生物體基因組中機(jī)械剪切（超聲）或內(nèi)切酶酶解后分離出目的基因；②提取組織中的mRNA，以其為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的cDNA；③人工體外合成；④利用PCR技術(shù)擴(kuò)增特定的基因片段。通過mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，不但可以獲得較為完整的連續(xù)編碼順序，且容易在宿主中實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)[11]。

根據(jù)質(zhì)粒載體pcDNA4/HisMaxA和目的片段cRNA序列酶切位點(diǎn)特征，分別在上游引物5，端加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5，端加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。當(dāng)目的基因與載體分別經(jīng)上述二種酶雙酶切后，便產(chǎn)生兩個(gè)不同的粘性末端，使目的基因IL-10 cDNA片段與質(zhì)粒載體在適當(dāng)位點(diǎn)發(fā)生定向重組。此方法具有連接效率高、連接點(diǎn)保留原來酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)，插入片段的方向唯一，從而保證了目的基因與表達(dá)載體連接的準(zhǔn)確性。

本文實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)，提取總RNA，采用RT-PCR方法進(jìn)行基因擴(kuò)增，獲得目的片段后將其與質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，所獲得的片段基因序列與IL-10的序列一致，實(shí)現(xiàn)了IL-10基因克隆及重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，為今后臨床進(jìn)一步研究IL-10基因治療以及相關(guān)蛋白提純、抗體制備奠定了基礎(chǔ)。

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