毛婭卿，王 嘉，王 哲，吳 濤

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和應用，疫苗的研制和開發(fā)取得了快速的發(fā)展。以重組病毒作為基因工程活載體疫苗，可同時啟動機體細胞免疫和體液免疫，避免了滅活疫苗的缺陷，又無常規(guī)疫苗毒力返強之虞，尤為重要的是可以同時構(gòu)成多價乃至多聯(lián)疫苗，使之成為近幾年來新型疫苗研制最為活躍也是最有希望的發(fā)展方向。然而，大多數(shù)野生型病毒對機體都具有致病性。因此需要對其進行改造后才能用于機體。原則上，各種類型的病毒都能被改造成病毒載體。但是由于病毒的多樣性及與機體復雜的依存關(guān)系，人們至今對許多病毒的生活周期、分子生物學、與疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系等的認識還很不全面，從而限制了許多病毒發(fā)展成為具有實用性的載體。近20年來，只有少數(shù)幾種DNA病毒及RNA病毒被成功地改造成為基因轉(zhuǎn)移載體［1］并開展了不同程度的應用。

1 DNA病毒載體

1．1 痘病毒載體 痘病毒科是一大群、專性的病毒，感染的痘病毒病毒粒子形狀呈磚形，直徑300～400 nm，基因組由130～300 kb的單線雙鏈DNA分子組成。

痘病毒在病毒學、免疫學和疫苗學等方面發(fā)揮著十分重要的作用。1789年，Dr．Edward Jenner證明牛痘病毒可以用于人類的免疫接種，預防天花的感染，這一發(fā)現(xiàn)奠定了免疫學的基礎(chǔ)，同時也為實施全球性的免疫接種，并最終為從地球上消滅天花奠定了基礎(chǔ)。后來，牛痘病毒被痘苗病毒(vaccinia virus，VV)所取代。1980年，世界衛(wèi)生組織宣布人類消滅了天花，建議不再進行天花的疫苗接種。在過去的20多年中科學工作者做出了不懈的努力以改進重組病毒的安全性，這種改進措施包括兩個方面，一方面是通過基因工程手段對VV進行致弱，另一方面是用禽痘病毒載體作為替代，構(gòu)建安全高效表達外源基因的非復制型載體。目前，在基因的表達、疾病治療和疫苗開發(fā)方面，禽痘病毒已經(jīng)成了使用最為廣泛的表達載體，在禽類疾病新型疫苗的研制方面得到了很好的應用。這些年，痘病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應用見表1。

表1 痘病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應用［2-5］

1．2 皰疹病毒載體 皰疹病毒科分為4個亞科:皰疹病毒甲亞科、皰疹病毒乙亞科、皰疹病毒丙亞科及未定名亞科。同痘病毒一樣，皰疹病毒的基因組較大，約150 kb，可容納多個外源基因的插入。

大多數(shù)皰疹病毒(偽狂犬病毒除外)的宿主范圍很窄，其重組病毒的使用不會產(chǎn)生流行病學方面的不良后果。許多皰疹病毒經(jīng)黏膜途徑感染，構(gòu)建的活載體疫苗可經(jīng)黏膜途徑提呈抗原，誘導特異性黏膜免疫。皰疹病毒活載體主要包括單純皰疹病毒、偽狂犬病毒、火雞皰疹病毒、I型牛皰疹病毒、河馬皰疹病毒I型。其中，偽狂犬病毒活載體疫苗是病毒基因工程研究中比較活躍的領(lǐng)域，I型牛皰疹病毒活載體疫苗也有諸多相關(guān)報道。這些年，皰疹病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應用見表2。

表2 皰疹病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應用［6-7］

1．3 腺病毒載體 腺病毒屬于腺病毒科，根據(jù)宿主范圍不同，將腺病毒分為哺乳動物腺病毒和禽類腺病毒兩個屬。

腺病毒載體能高效表達外源基因，并能對外源蛋白進行剪切、糖基化、磷酸化等反應后加工，表達的蛋白具有天然蛋白的特性，可用于制藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域，已展現(xiàn)出良好的應用前景。重組腺病毒可以通過注射、口服、氣管接種等途徑進行免疫，接種動物不僅產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，而且還可以產(chǎn)生局部黏膜免疫應答，對預防呼吸道、消化道的感染具有極其重要的意義。這些年，腺病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應用見表3。

1．4 桿狀病毒載體 昆蟲桿狀病毒研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒和家蠶核型多角體病毒，用來表達外源蛋白也多用這兩種桿狀病毒載體。

表3 腺病毒載體在獸用疫苗研發(fā)方面的應用［8-9］

桿狀病毒表達載體是一種輔助性依賴的真核DNA表達載體，已有近千種外源基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)得到表達。Wang SP等構(gòu)建了豬繁殖與呼吸綜合征病毒修飾的ORF5和ORF6雙基因共表達的重組假型桿狀病毒疫苗，小鼠免疫試驗證實，重組病毒所誘導的IFN－γ水平和中和抗體水平均明顯高于常規(guī)DNA疫苗免疫組［10］。余光清等也用該系統(tǒng)構(gòu)建了表達日本血吸蟲的谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GST)的重組DNA疫苗，也獲得了較好的免疫保護力。除此之外，重組桿狀病毒表達偽狂犬病毒糖蛋白、流感病毒血凝素、兔病毒性出血癥病毒VP60蛋白等的DNA疫苗也獲得了較好的免疫效果［11－12］，表明重組桿狀病毒 DNA疫苗是一種具有良好發(fā)展前景的疫苗載體。

2 RNA病毒載體

2．1 副粘病毒載體 副粘病毒成多形性，直徑150 nm或更大，有包膜。病毒粒內(nèi)含呈螺旋對稱的核殼，核酸是一條連續(xù)的單鏈RNA長分子。

隨著反向遺傳學操作技術(shù)的發(fā)展，越來越多的RNA病毒成為病毒載體的研究對象，副粘病毒科中的新城疫病毒(NDV)的研究相對比較成熟，其基因組結(jié)構(gòu)、分子特性及其相關(guān)性質(zhì)了解的比較透徹，應用研究的也比較多［13］。Nakaya T［14］等在NDV Hitchner B1株P(guān)和M基因之間分別插入了CAT報告基因和流感病毒的HA基因，小鼠體內(nèi)試驗能抵抗致死劑量的流感病毒的攻擊，說明NDV作為疫苗載體是非常有效的。Ge JY等在NDV P和M基因之間分別插入高致病性禽流感(HPAIV)的野毒株和變異株的HA基因，在活體試驗中均能抵抗致死劑量的NDV和AIV的攻擊，說明用NDV載體做二聯(lián)苗是非常有前景的。

NDV載體作為一種重要的分子生物學工具，不僅在疫苗研究方面具有不可替代的地位，而且作為基因治療載體的研究也日益進展。雖然NDV抗腫瘤的確切的機制尚未完全闡明，但隨著基礎(chǔ)醫(yī)學和分子病毒學的發(fā)展，NDV作為一種有效的病毒載體具有廣闊的應用前景是毋庸置疑的。

2．2 彈狀病毒載體 彈狀病毒粒是形態(tài)似棒狀或子彈狀的一科。病毒粒的大小為(130～380)nm×70 nm，核心為螺旋對稱的核殼，內(nèi)含連續(xù)線型單負鏈 RNA，分子量為(3．5 ～4．6)×106。

其中的水皰性口炎病毒(vesivularstomatitis virus，VSV)載體已被開發(fā)成為一種有效的治療制劑［15］。VSV病毒載體是一種高效的溶瘤病毒載體，具有非常廣的溶瘤范圍。VSV載體也被開發(fā)成為一種有效的疫苗載體，VSV作為疫苗載體應用到獲得性免疫綜合癥病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制過程中。

2．3 甲病毒載體 甲病毒屬于披膜病毒科，包括辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等30個成員。

甲病毒是一類能在宿主細胞的胞質(zhì)內(nèi)大量復制的RNA病毒。用外源基因替換結(jié)構(gòu)蛋白基因的甲病毒載體，仍具有甲病毒的宿主感染譜廣泛、能夠自我復制、誘導被轉(zhuǎn)染細胞發(fā)生凋亡等眾多生物學特性，同時能夠大量表達外源基因，激發(fā)機體產(chǎn)生高效的免疫反應，并不易與宿主基因組整合［16］。利用甲病毒的生物學特性，改造出相應的甲病毒載體，已被廣泛地應用于基因治療和分子生物學研究領(lǐng)域。1996年，Invitrogen公司率先推出了商品化的甲病毒載體［17］。

2．4 冠狀病毒載體 冠狀病毒粒子呈不規(guī)則形狀，直徑約60～220 nm。其核酸為非節(jié)段單鏈(+)RNA，長27～31 kd，是 RNA病毒中最長的RNA核酸鏈。

目前已經(jīng)開發(fā)出了兩類基于冠狀病毒的表達載體，即輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)和單基因組表達載體系統(tǒng)。通過對冠狀病毒感染性cDNA進行改造可以獲得外源基因的高效、穩(wěn)定表達［18］。此外，冠狀病毒載體以下幾個特征使其成為非常具有吸引力的載體:①通過刪除非結(jié)構(gòu)基因、組織特異性基因可以將冠狀病毒轉(zhuǎn)化為無毒力的病毒;②通過對S蛋白的改造可以改變冠狀病毒的組織和物種嗜性，從而將外源基因定向表達到不同的組織器官或物種。因此，冠狀病毒對于疫苗開發(fā)以及基因治療是前景非常好的載體。

2．5 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 反轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒特征為其基因組是雙股(+)RNA，具有二十面體對稱核心，內(nèi)含核醣蛋白，外有包膜。

反轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)是一種新的重組蛋白高效表達系統(tǒng)［19］，由反轉(zhuǎn)錄病毒載體、包膜蛋白載體和包裝細胞系組成。反轉(zhuǎn)錄病毒載體具有基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作、轉(zhuǎn)染效率高、容量較大、宿主范圍廣、易于分離等優(yōu)點，在外源基因表達、基因治療、轉(zhuǎn)基因研究、生物制藥等方面應用廣泛。

2．6 黃病毒載體 黃病毒屬是一大群具有包膜的單正鏈RNA病毒。在我國，主要的黃病毒成員有乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒和登革病毒。

目前所有黃病毒載體疫苗的研發(fā)均處于臨床前階段，而與其異常相近的黃病毒嵌合疫苗卻發(fā)展得更為迅速。黃病毒嵌合疫苗［20］，是以一種黃病毒的結(jié)構(gòu)基因替代另一種黃病毒的相同基因而獲得的疫苗。由于外源基因和載體病毒之間的種間差異小，替代的基因具有類似的功能，所以嵌合疫苗的技術(shù)難度相對較低。與載體疫苗相比，嵌合疫苗技術(shù)只能用于預防性疫苗的研制，并且應用范圍僅限于黃病毒預防疫苗。但這種技術(shù)與黃病毒載體技術(shù)極其類似，其應用經(jīng)驗可作為黃病毒載體技術(shù)的基礎(chǔ)，因此，這種技術(shù)的迅猛發(fā)展也預示著黃病毒載體技術(shù)具有美好的發(fā)展前景。

3 病毒載體之比較

每種病毒載體都存在各自的優(yōu)劣勢，它們之間的比較見表4。

表4 各種病毒載體優(yōu)劣勢比較

續(xù)表

4 結(jié)語

目前，盡管病毒載體系統(tǒng)在研究和實驗上取得了很大的進展，數(shù)個病毒載體已實現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的長時間表達，且多個病毒載體能同時啟動機體細胞免疫和體液免疫，但病毒載體的安全性和靶向性問題還有待進一步的研究解決。研究表明通過使用組織特異性啟動子或多聚物和脂質(zhì)體的修飾，可提高基因轉(zhuǎn)移的靶向性，且多聚物和脂質(zhì)體的修飾還可減輕免疫反應，有利于載體的重復應用。針對有些病毒載體插入外源基因的能力較低、插入宿主基因組、多次免疫后機體產(chǎn)生針對載體部分的抗體、轉(zhuǎn)基因生物釋放等的劣勢，可調(diào)控表達外源基因的病毒載體、靶向性載體、無病毒基因的病毒載體甚至是自我滅活或自我破壞的病毒載體應該是今后努力的目標。相信隨著技術(shù)的進步，病毒載體系統(tǒng)會得到進一步完善提高，從而早日實現(xiàn)病毒活載體疫苗的產(chǎn)業(yè)化。

［1］ Alejandro Brun，Emmanuel Albina，Tom Barret，et al．Antigen delivety systems for veterinary vaccine development Viral－vector based delivery systems［J］．Vaccine，2008，26:6508 －6528．

［2］ 金寧一，殷 震．痘苗病毒載體研究進展［J］．生物化學與生物物理進展，1996，23(4):301 －304．

［3］ 孫 鵬，王云峰，胡桂學．禽痘病毒載體及其應用［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(9):82 －85．

［4］ Merchlinsky M，Moss B．Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation:Recombinationindependent selectable cloning vectors．Virology，1992，190(9):522－556．

［5］ Boyle D B，Anderson M A，Amos R，et al．Construction of recombinant fowlpox viruses carrying multiple vaccine antigens and immunomodulatorymolecules．Biotechniques，2004，37(7):8 －11．

［6］ 劉培欣，曹殿軍．重組火雞皰疹病毒載體疫苗研究進展［J］．畜牧獸醫(yī)科技信息，2003，11:118 －121．

［7］ Otsuka H，Xuan X，Shibata I，et al．Protective immunity of bovine herpesvirus－1(BHV－1)recombinants which express pseudorabies virus(PRV)glycoproteins gB，gC，gD，gE［J］．J Vet Med Sci，1996，58:8219 －8224．

［8］ 王玉泉，馬立賓，于秋蓮．動物腺病毒載體的研究進展［J］．內(nèi)蒙古民族大學學報(自然科學版)，2009，24(2):180－183．

［9］ Reddy P S，Idamakanti N，Chen Y，et al．Replication － defective bovine adenovirus type 3 as an expression vectorr［J］．Journal of Virology，1999，73(11):9137 －9144．

［10］王立良，宋國興，司馬懿．桿狀病毒載體研究進展［J］．國外醫(yī)學分子生物學分冊，1998，20(5):222 －226．

［11］曹 虎．桿狀病毒載體研究進展［J］．國外醫(yī)學分子生物學分冊，1998，20(5):222 －226．

［12］ Huser A，Rudolph M，Hofmann C．Incorporation of decay－accelerating factor into the baculovirusenvelope generates complementresistant gene transfer vectors［J］．Nat Biotechnol 2001，19:451－455．

［13］孫玉章，母連志，丁 壯．新城疫病毒載體研究進展［J］．動物醫(yī)學進展，2009，30(11):91 －94

［14］ Peeters B P，de Leeuw O S，Verstegen I，et al．Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals［J］．Vaccine，2001，19(2):1616 －1627．

［15］ Ezelle H J，Markovic D，Barber G N．Generation of hepatitis C virus－like particles by use of a recombinant vesicular stomatitis virus vector［J］．JVirol，2002，76(12):12325 －12334．

［16］周 鵬，聶 奎．甲病毒載體疫苗研究進展［J］．中國生物制品學雜志，2006，7:430 －433．

［17］ Lundstrom K．Alphavirus vectors:applications for DNA vaccine production and gene expression［J］．Intervirology，2000，43:247－257．

［18］ Enjuanes L，Sola I，Alonso S，et al．Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression［J］．Curr Top Microbiol Immunol，2005，287:161 －197．

［19］朱春雨，侯 銳，高福蓮．反轉(zhuǎn)錄病毒載體的研究進展［J］．新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2012，1:85 －87．

［20］ 郭銀漢，王曉鵬．黃病毒載體技術(shù)［J］．病毒學報，2005，21(6):485－487．