劉淑紅，焦鐵軍，李河林，2，白 軍，2，王運宏，黃建斌，張娟娟，渠淑華

(1．楊凌綠方生物工程有限公司，陜西楊凌 712100;2．西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊陵 712100)

禽流感(Avian influenza，AI)和新城疫(Newcastle disease，ND)均可引起多種家禽及鳥類發(fā)病，被世界動物衛(wèi)生組織列為A類傳染病。目前我國AI的流行以低致病性H9亞型為主，該亞型病毒雖然很少引起發(fā)病和死亡［1］，但在繼發(fā)或并發(fā)感染ND病毒等病原的情況下，仍可引起禽類的高發(fā)病率和高死亡率;H9亞型AI病毒與ND病毒還可以跨越種屬屏障直接感染人［2－4］，因此對這兩種疾病的研究，具有重要的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生意義。

目前，一般采用疫苗接種來預防這兩種傳染病，為有效控制這兩種疾病的發(fā)生與流行，本試驗以從患病雞中分離到的H9亞型AI病毒 SY株和ND病毒La Sota株為種毒研制了二聯(lián)滅活疫苗，現(xiàn)將該疫苗的安全性和免疫效力試驗結(jié)果報告于下。

1 材料與方法

1．1 疫苗 新城疫、禽流感(H9亞型，SY株)二聯(lián)滅活疫苗(簡稱二聯(lián)苗)，由楊凌綠方生物工程有限公司研發(fā)中心實驗室制備，批號為090325。

1．2 實驗動物 SPF雛雞:SPF種蛋由北京梅里亞維通實驗動物有限公司供應，自行孵化出雛后置負壓隔離器內(nèi)飼喂至所需日齡。產(chǎn)蛋雞:6月齡羅曼蛋雞，楊凌某雞場。

1．3 禽用負壓隔離器 黑龍江靈鼠科技開發(fā)有限責任公司生產(chǎn)。

1．4 病毒及檢驗試劑 H9亞型AI病毒SY株，108．5EID50/0．1mL，由本實驗室保存;雞新城疫血凝抑制試驗抗原，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原，哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。

1．5 安全性試驗

1．5．1 SPF雛雞安全性試驗 將28日齡 SPF雞隨機分為7組，每組10只，第1、2組分別以肌肉注射和皮下注射的方式接種二聯(lián)苗0．5 mL;第3、4組分別以肌肉注射和皮下注射的方式接種二聯(lián)苗1．0 mL;第5、6組分別以肌肉注射和皮下注射的方式接種二聯(lián)苗0．5 mL，2周后以相同方法再次接種二聯(lián)苗0．5 mL;第7組不免疫作為對照。所有試驗雞接種后觀察21 d，并在免疫后21 d進行剖檢。

1．5．2 產(chǎn)蛋雞安全性試驗 將6月齡產(chǎn)蛋雞分為7組，每組30只，第1、2組分別以肌肉注射和皮下注射的方式接種二聯(lián)苗0．5 mL;第3、4組分別以肌肉注射和皮下注射的方式接種二聯(lián)苗1．0 mL;第5、6分別以肌肉注射和皮下注射的方式接種二聯(lián)苗0．5 mL，2周后以相同方法再次接種二聯(lián)苗0．5 mL;第7組不免疫作為對照。接種后1個月內(nèi)觀察試驗雞有無局部或全身不良反應;并統(tǒng)計雞群最后一次接種后1個月內(nèi)的產(chǎn)蛋率。

1．6 免疫效力試驗

1．6．1 血清抗體檢測 將30日齡SPF雞隨機分成3 組，每組30 只，第1、2 組分別按 0．3、0．5 mL/只的劑量接種二聯(lián)苗;第3組不免疫作為對照。從每組試驗雞中隨機抽取10只，在接種前及接種后不同時間采血，分離血清，分別測定ND HI、AIHI抗體效價。

1．6．2 免疫攻毒試驗 將上述試驗雞于免疫后7、14 d隨機抽取10只，分別靜脈注射AI病毒SY株病毒液0．2mL(含108．0EID50)，并于攻毒后第5 天，按照文獻［5］中方法對試驗雞進行病毒分離。

1．7 HI抗體檢測 參照GB/T 17999．2－2008進行。

2 結(jié)果

2．1 安全性試驗結(jié)果

2．1．1 SPF雛雞安全性試驗結(jié)果 28日齡SPF雞以不同的接種方式無論單劑量、超劑量還是單劑量重復接種二聯(lián)苗后，所有試驗雞精神、食欲、糞便等均正常，未見任何不良反應，第21天剖檢可見接種部位無炎癥、無結(jié)節(jié)，疫苗吸收良好。

2．1．2 產(chǎn)蛋雞安全性試驗結(jié)果 6月齡蛋雞接種不同劑量二聯(lián)苗后，精神狀態(tài)良好，采食飲水正常，糞便等未見異常;免疫后1個月內(nèi)免疫雞的產(chǎn)蛋率略低，與對照雞相比，相差0．24% ～1．07%(表1)。

表1 二聯(lián)苗免疫后1個月內(nèi)試驗雞的產(chǎn)蛋率

2．2 免疫效力試驗結(jié)果

2．2．1 抗體檢測結(jié)果 結(jié)果見表2、表3、圖1、圖2。

表2 ND病毒HI抗體檢測結(jié)果

表3 AI病毒HI抗體檢測結(jié)果

從圖中可看出，免疫后7 d，試驗雞均檢測到ND、AIHI抗體，但抗體水平較低，免疫后14 d時產(chǎn)生較高水平的抗體;免疫后5周內(nèi)，抗體水平逐漸升高并達到峰值，高峰期時抗體幾何平均值ND HI≥1 ∶1024，AIHI≥1 ∶891;此后抗體逐漸下降，0．3 mL組試驗雞免疫二聯(lián)苗后20周，HI抗體降至臨界水平，ND HI幾何平均值為1∶23，AIHI幾何平均值為1∶119，而0．5 mL組試驗雞免疫二聯(lián)苗后其HI抗體水平至免疫后30周才降至臨界水平;在整個試驗期間，第1組試驗雞產(chǎn)生的HI抗體始終低于第2組，而對照雞的HI抗體均處于陰性水平。2．2．2 攻毒試驗結(jié)果 見表4。疫苗免疫后7 d攻擊AI病毒SY株，免疫雞病毒分離率超過6/10，免疫后14 d攻毒免疫雞，病毒分離率為0。

表4 SPF雛雞免疫后攻擊AI病毒SY株后病毒分離結(jié)果

3 討論

由于AI病毒一直存在變異與進化，在試驗前期用近幾年分離到的H9N2亞型毒株進行了“二聯(lián)苗接種SPF雞后對H9亞型AI病毒流行毒株的攻毒保護試驗”，結(jié)果表明，以早期分離的毒株制備的疫苗可以抵抗近幾年分離到的H9亞型AI病毒的攻擊，這與目前我國眾多學者［6－7］的研究結(jié)果相一致。而傳統(tǒng)的疫苗株ND病毒La Sota株對目前流行的ND強毒亦具有很好的交叉保護性［8］。因此，選用AI病毒SY株和ND病毒La Sota株作為制苗毒株制備二聯(lián)滅活苗。

安全性試驗結(jié)果表明，二聯(lián)苗以皮下注射和肌肉注射的方式超劑量免疫SPF小雞后，試驗雞未見異常，說明二聯(lián)苗安全性良好;二聯(lián)苗以不同的接種方式超劑量免疫6月齡羅曼蛋雞后，免疫雞產(chǎn)蛋率與對照雞相比略有下降(月產(chǎn)蛋率下降不超過1．07%)，考慮到疫苗免疫引起的應激反應亦可引起試驗雞產(chǎn)蛋率的下降，故認為疫苗本身對產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能影響不大。說明二聯(lián)苗對雛雞與產(chǎn)蛋雞均是安全的。

根據(jù)李慧姣［9］、唐秀英［10］等的研究結(jié)果，ND HI抗體效價與抗攻毒保護成正相關，當ND HI≥1∶16，攻毒保護率可達86．7%以上;AIHI抗體效價≥1∶64時，對H9亞型AI病毒的攻毒保護率可達100%。該二聯(lián)苗接種試驗雞后2周ND HI抗體幾何平均值不低于1∶128，AIHI抗體幾何平均值不低于1∶74，攻擊AI病毒SY株病毒液后病毒分離率為0。免疫后20周，ND HI抗體幾何平均值不低于1∶23，AIHI抗體幾何平均值不低于1∶119，因此，二聯(lián)苗的免疫期至少可持續(xù)20周。

［1］ 萬曉朋，曾顯營，田國彬．H9N2亞型禽流感流行株滅活疫苗種毒的篩選［J］．中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(4)︰276－280．

［2］ 郭元吉，李建國，程小雯．禽 H9N2亞型流感病毒能感染人的發(fā)現(xiàn)［J］．中華實驗和臨床病毒學雜志，1999，13(2)︰105－108．

［3］ 李 靖，劉伯華，祝慶余．禽流感病毒跨種屬感染人的機制研究進展［J］．微生物學通報，2005，32(3)︰121 －124．

［4］ 陳麗穎，王亞賓，張紅英，等．幼鴿暴發(fā)新城疫及其對人感染報告［J］．中國人獸共患病學報，1999，15(5):113 －117．

［5］ 劉麗平，焦新安，張小榮．減毒沙門菌運送的H9N2亞型禽流感病毒DNA疫苗的研制及其免疫試驗［J］．動物醫(yī)學進展，2007，28(9)︰1 －6．

［6］ 景小冬，章振華，李 林，等．H9亞型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保護試驗［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(6)︰134－137．

［7］ 童海兵，張小榮，吳艷濤，等．H9N2亞型禽流感病毒的遺傳進化分析及F株滅活疫苗的免疫效果評價［J］．中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(12)︰933 －936．

［8］ 王友令，徐懷英，李 莉，等．新城疫La Sota疫苗對不同基因型流行株的免疫保護［J］．浙江農(nóng)業(yè)學報，2009，21(5)︰446－449．

［9］ 李慧姣，蔣桃珍，李啟紅，等．雞新城疫滅活疫苗免疫攻毒試驗與血清學(HI)試驗的平行關系研究［J］．中國獸醫(yī)雜志，2004，38(8):5 －8．

［10］ 唐秀英，付朝陽．重新審視禽流感［J］．中國家禽，2001，23(12)︰7－9．