馬 潔，黃 靜，曾延波，張祖磊，張 劍，陳智棟，李 蕾*

(1．常州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 常州 213016;2．嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

分子印跡聚合物具有預(yù)定選擇性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)環(huán)境的耐受性好和制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此在固相萃取、傳感器、催化等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1－4］。磁性分離是在磁場(chǎng)的作用下依據(jù)物質(zhì)的磁性差異，將磁性組分與非磁性組分分離的一種技術(shù)［5］。將磁性分離技術(shù)與分子印跡技術(shù)相結(jié)合制備的磁性分子印跡聚合物(M-MIPs)，兼具分子印跡聚合物和磁性材料的特點(diǎn)，可選擇性分離富集分析物，使之在外磁場(chǎng)的作用下快速與基質(zhì)分離。近年來(lái)基于磁性材料的分子印跡聚合物逐漸成為研究熱點(diǎn)。

蘇丹紅是一種人工合成的工業(yè)染料，國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)將其列為三類致癌物質(zhì)［6］，但一些不法食品企業(yè)將其作為食品色素，嚴(yán)重危害消費(fèi)者健康。目前食品中蘇丹紅Ⅰ的檢測(cè)方法主要有HPLC法、GCMS聯(lián)用法、電化學(xué)檢測(cè)法等［7－10］，而這些方法大都需要繁瑣的樣品前處理過(guò)程。用分子印跡聚合物作為萃取材料，可簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程［11－14］，但通常需將其離心分離或者用于填充柱，分離過(guò)程仍較繁瑣，而M-MIPs在外磁場(chǎng)作用下可與基質(zhì)快速分離，因此，M-MIPs的使用降低了樣品預(yù)處理的復(fù)雜性，提高了方法的可靠性。本文以3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)修飾的 Fe3O4為磁性組分，以蘇丹紅Ⅰ為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，制備了磁性分子印跡聚合物，并將其用于辣椒粉提取液中蘇丹紅Ⅰ的分離富集，在外磁場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)快速分離，用甲醇洗脫，并結(jié)合液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有操作簡(jiǎn)單、選擇好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光譜儀(日本島津公司)，Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，NEXUS470型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)熱電尼高力公司)，Hitachi s-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)，JEM-200CX型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)，Lake Shore 7410型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(美國(guó)Lake Shore Cryotronics公司)。

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)(分析純，上海晶純?cè)噭┯邢薰?;蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、氨水、乙酸(分析純)及甲基丙烯酸(MAA，化學(xué)純，使用前提純)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%)、偶氮二異丁腈(AIBN，98%)(使用前提純，上海百靈威有限公司);甲醇、氯仿、乙腈(分析純);超純水(實(shí)驗(yàn)室自制);辣椒粉購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 蘇丹紅Ⅰ磁性分子聚合物(M-MIPs)的制備

取2 g制備的Fe3O4顆粒［15］于三口燒瓶中，加入38 mL無(wú)水乙醇和2 mL水，再加入0.4 mL MPS，超聲0.5 h后，在回流溫度下攪拌反應(yīng)3 h［16］得到MPS修飾的Fe3O4顆粒。

取1 mmol(0.25 g)蘇丹紅Ⅰ溶于50 mL乙腈中，加入4 mmol(0.34 mL)MAA超聲0.5 h后，加入10 mmol(1.89 mL)交聯(lián)劑EGDMA、1 g MPS修飾的Fe3O4和0.1 g引發(fā)劑AIBN，N2氛圍下65℃聚合反應(yīng)24 h。空白印跡聚合物(M-NMIPs)的制備方法同上，只是制備過(guò)程中未加模板分子。

M-MIPs用索氏提取器抽提(抽提液為體積比為9∶1的甲醇－乙酸)直至檢測(cè)不到模板分子，用甲醇洗去殘留乙酸后，于60℃真空干燥過(guò)夜。

1.3 聚合物的吸附性能測(cè)試

1.3.1 靜態(tài)吸附性能研究 稱取20 mg M-MIPs加入到錐形瓶中，然后分別加入5 mL不同濃度(0.3～3.0 mmol/L)的蘇丹紅Ⅰ－乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫振蕩12 h后，用磁鐵吸附M-MIPs，取清液用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定平衡時(shí)蘇丹紅Ⅰ的濃度，根據(jù)吸附前后的濃度變化，計(jì)算M-MIPs對(duì)不同濃度蘇丹紅Ⅰ溶液的吸附量Q，其公式為Q=(C0－Ce)V/m，其中Q為靜態(tài)平衡時(shí)的吸附量(μmol/g)，C0為底物的初始濃度(mmol/L)，Ce為吸附平衡時(shí)清液的濃度(mmol/L)，V為底物溶液的體積(L)，m為磁印跡材料的加入量(g)。M-NMIPs使用上述方法測(cè)定結(jié)合量并與M-MIPs相比較。

1.3.2 選擇性吸附實(shí)驗(yàn) 為研究聚合物的選擇性，將蘇丹紅Ⅱ和蘇丹紅Ⅲ(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)作為底物，用平衡吸附實(shí)驗(yàn)研究聚合物的識(shí)別性能。將20 mg M-MIPs放入5 mL分別含有1.0 mmol/L的蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ和蘇丹紅Ⅲ的乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液中，室溫振蕩12 h后，用磁鐵吸附聚合物，取清液用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定平衡時(shí)底物的濃度，根據(jù)吸附前后的濃度變化，計(jì)算聚合物對(duì)3種底物的結(jié)合量，M-NMIPs使用同樣方法測(cè)定。

圖1 蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ和蘇丹紅Ⅲ的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of SudanⅠ，SudanⅡand SudanⅢ

1.4 樣品加標(biāo)處理及萃取過(guò)程

在1 g辣椒粉表面噴灑1 mL的蘇丹紅Ⅰ－乙腈溶液(加標(biāo)濃度為1.5～60 μg/g)，靜置過(guò)夜后，用5 mL乙腈超聲提取10 min，離心取上清液，殘?jiān)僦貜?fù)提取2次，合并提取液。

將60 mg M-MIPs加入到提取液中，振蕩吸附12 h后用強(qiáng)磁鐵將吸附劑與清液分離。用2 mL甲醇溶液對(duì)吸附劑超聲洗脫，洗脫液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，再使用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。

色譜條件:Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)包括G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱保溫箱，G1315D二極管陣列檢測(cè)器，G1329A進(jìn)樣器。色譜柱:反相Extend－C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱溫:35℃;流動(dòng)相:50%甲醇水溶液－色譜純甲醇(10∶90);檢測(cè)波長(zhǎng):478 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性分子印跡聚合物的制備

本文利用MPS修飾的Fe3O4粒子為磁性組分，制備了蘇丹紅Ⅰ的磁性分子印跡聚合物，具體制備路線及應(yīng)用如圖2所示。

圖2 蘇丹紅ⅠM-MIPs的制備與應(yīng)用過(guò)程Fig.2 Schematic diagram of the fabrication and application process of SudanⅠM-MIPs

2.2 紅外光譜分析

圖3是各‖種聚合物的紅外表征圖譜。2 919 cm－1和2‖ 857 cm－1是飽和C—H的伸縮振動(dòng)峰，1 750 cm－1是MPS中CO的伸縮振動(dòng)峰，1 620 cm－1為MPS中CC雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 123 cm－1為MPS中Si—O鍵的伸縮振動(dòng)峰，580 cm－1處為Fe3O4中Fe—O鍵的特征吸收峰。對(duì)比曲線a、b可知MPS已經(jīng)成功結(jié)合到Fe‖3O4粒子的表面［16－17］。M-MIPs曲線(c)中，1 460、1 390 cm－1處是甲基的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，聚合物中CO的振動(dòng)峰(1 732 cm－1)顯著增強(qiáng)。

圖3 Fe3O4納米顆粒(a)、MPS修飾的Fe3O4(b)和M-MIPs(c)的紅外光譜圖Fig.3 FT－IR spectra of Fe3O4nanoparticles(a)，F(xiàn)e3O4modified with MPS(b)and M-MIPs(c)

2.3 磁性分子印跡聚合物的形貌結(jié)構(gòu)分析

用掃描電鏡/透射電鏡(SEM/TEM)對(duì)各磁性微球的形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。由圖4A中Fe3O4的SEM/TEM圖可以看到，用共沉淀法制備的Fe3O4磁性顆粒呈規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，且粒徑比較均勻。由圖4B可以看到，由于在MPS修飾的Fe3O4微球表面進(jìn)行印跡聚合作用，使得部分M-MIPs微球稍有粘連現(xiàn)象;從M-MIPs的TEM圖可以看到，其外殼薄膜厚度較大，這是由于聚合反應(yīng)過(guò)程中參與反應(yīng)的有機(jī)物的量很多，從而導(dǎo)致聚合物的有機(jī)物層變厚［18］，說(shuō)明已成功制備得到M-MIPs。

圖4Fe3O4納米顆粒(A)及M-MIPs(B)的TEM/SEM圖Fig.4 TEM/SEM images of Fe3O4nanoparticles(A)and M-MIPs(B)

2.4 磁性分子印跡聚合物的磁性能表征

考察了幾種材料的常溫磁滯回歸曲線(見(jiàn)圖5A)。由圖可知，由于Fe3O4顆粒表面包裹物的增加，F(xiàn)e3O4顆粒、MPS修飾的Fe3O4、M-MIPs的飽和磁化強(qiáng)度依次降低。圖5B中左側(cè)為MMIPs的分散液，右側(cè)為在外磁場(chǎng)下M-MIPs的分散液，可以看出M-MIPs具有良好的磁性能，在強(qiáng)磁鐵的作用下，分散了M-MIPs的溶液立刻澄清，表明M-MIPs可滿足磁分離需求。

圖5 幾種材料的常溫磁滯回歸曲線(A)及M-MIPs在外磁場(chǎng)下的分離示意圖(B)Fig.5 The magnetization curves of several materials(A)and the separation process of M-MIPs in the presence of an external magnetic field(B)a．Fe3O4nanoparticles，b．Fe3O4modified with MPS，c．M-MIPs

2.5 吸附等溫線

采用靜態(tài)平衡法，測(cè)定了印跡聚合物和非印跡聚合物對(duì)不同濃度蘇丹紅Ⅰ的吸附等溫線(見(jiàn)圖6)。

分子印跡聚合物的結(jié)合特性常用Scatchard模型［19］來(lái)評(píng)價(jià):Q/Ce=(Qmax－Q)/Kd，式中Kd是平衡離解常數(shù)，Qmax和Q分別為M-MIPs對(duì)蘇丹紅Ⅰ的最大吸附量和理論平衡吸附量(μmol/g)。

以Q/Ce對(duì)Q作圖即得 Scatchard曲線(圖7)，M-MIPs對(duì)蘇丹紅Ⅰ的吸附作用并非完全等價(jià)，而是存在兩類不同的結(jié)合位點(diǎn)。將圖中線性較好的兩個(gè)部分分別進(jìn)行擬合，得到擬合線性方程:Q/Ce=－1.127Q+95.33(r=0.977 8)和Q/Ce=－0.308Q+64.83(r=0.998 8)。由線性方程的斜率和截距可以求得Kd1=0.89 mmol/L，Kd2=3.25 mmol/L，Qmax1=84.59 μmol/g，Qmax2=210.49 μmol/g;M-NMIPs的 Scatchard 曲線則是一條線性相關(guān)曲線，表明M-NMIPs的結(jié)合位點(diǎn)各向同性，所以只能形成一種非選擇性的結(jié)合位點(diǎn)。

2.6 選擇性吸附

采用靜態(tài)平衡法研究了聚合物對(duì)蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的選擇吸附性，并根據(jù)公式:KD=Qe/Ce計(jì)算出對(duì)應(yīng)的分配系數(shù)KD及相對(duì)選擇系數(shù)k(見(jiàn)表1)。式中KD為分配系數(shù)(L/g)，Qe為平衡吸附量(μmol/g)，Ce為吸附液中結(jié)構(gòu)類似物的平衡濃度;k=KD(template)/KD(analogue)［20］。

由表1可以看出M-MIPs對(duì)蘇丹紅Ⅰ的KD最大且明顯高于M-MIPs對(duì)其他兩種物質(zhì)的KD，表明其對(duì)蘇丹紅Ⅰ的吸附能力最強(qiáng)，而M-NMIPs對(duì)3種結(jié)構(gòu)類似物的KD較小且相差不大，表明其對(duì)3種物質(zhì)的吸附能力較低且相差不大;M-MIPs對(duì)蘇丹紅Ⅰ/蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ/蘇丹紅Ⅲ的k分別為2.47、2.24，明顯高于M-NMIPs對(duì)應(yīng)的k，表明M-MIPs對(duì)蘇丹紅Ⅰ選擇性較好。這是因?yàn)樵贛-MIPs中形成了與蘇丹紅Ⅰ空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)相匹配的空穴，而M-NMIPs由于其功能團(tuán)的分布是無(wú)序的，未能形成與蘇丹紅Ⅰ互補(bǔ)的識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)蘇丹紅Ⅰ不具特異選擇性。

表1 聚合物的KD及k值Table 1 KDand kvalues of the polymers

2.7 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按照“1.4”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸分析。在加標(biāo)濃度1.5～40 μg/g范圍內(nèi)，蘇丹紅Ⅰ峰面積 (A)與濃度(C)呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為A=3.533C－6.024，相關(guān)系數(shù)(r)為0.989，方法的檢出限(S/N=3)為0.50 μg/g。

2.8 辣椒粉提取液中蘇丹紅Ⅰ的測(cè)定

按照“1.4”方法用蘇丹紅Ⅰ M-MIPs和M-NMIPs分別對(duì)加標(biāo)辣椒樣品(加標(biāo)濃度分別為2.4、4.8、19.2 μg/g)進(jìn)行萃取處理，HPLC法測(cè)定。由表2可知，M-MIPs對(duì)應(yīng)的回收率為78%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～5.8%，其回收率明顯高于M-NMIPs的回收率(8%～27%)，表明M-MIPs對(duì)蘇丹紅Ⅰ有特異識(shí)別性。

表2 實(shí)際樣品中蘇丹紅Ⅰ的測(cè)定(n=3)Table 2 The detection of SudanⅠin paprika sample(n=3)

用 M-MIPs和 M-NMIPs對(duì)添加19.2 μg/g和未添加蘇丹紅Ⅰ的辣椒粉進(jìn)行萃取，以富集后液相峰面積與富集前液相峰面積之比計(jì)算得M-MIPs的富集倍數(shù)約為6，圖8為樣品的HPLC色譜圖。由圖可以看出，實(shí)際樣品中無(wú)蘇丹紅Ⅰ。

圖8 辣椒粉樣品(a)及加標(biāo)辣椒粉樣品(b、c)經(jīng)吸附萃取后洗脫液的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatograms for paprika samples(a)and spiked paprika samples(b，c)after extraction a，b:extracted with M-MIPs，c:extracted with M-NMIPs;spiked concentration of Sudan Ⅰ:19.2 μg/g

3 結(jié)論

本文以MPS修飾的Fe3O4為磁性組分，蘇丹紅Ⅰ為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，制備了磁性分子印跡聚合物。結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明該磁性印跡聚合物對(duì)蘇丹紅Ⅰ有較高的選擇性和吸附性。將該磁性印跡聚合物用于辣椒粉提取液中蘇丹紅Ⅰ的分離富集，用磁鐵將其與溶液快速分離，并經(jīng)高效液相色譜測(cè)得樣品的回收率為78%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～5.8%。

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