蔣 猛，劉振輝，易成臘，白祥軍

急性脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的病理生理過(guò)程主要由原發(fā)性機(jī)械性損傷和繼發(fā)性炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等損傷共同構(gòu)成。多種因素參與了繼發(fā)性脊髓損傷的病理過(guò)程，而且其后果往往比原發(fā)性損傷更為嚴(yán)重。在SCI急性期，局部產(chǎn)生大量興奮性毒性氨基酸、氮氧化物、過(guò)度的炎癥反應(yīng)及自由基等，可造成嚴(yán)重的繼發(fā)性神經(jīng)損害。脊髓損傷后，釋放的細(xì)胞因子可活化炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞并促使其黏附、吞噬、脫顆粒、釋放蛋白酶及氧自由基，破壞脊髓組織血管內(nèi)皮的完整性，加重脊髓水腫、壞死，使神經(jīng)功能惡化。繼發(fā)的炎癥反應(yīng)嚴(yán)重阻礙脊髓損傷后的修復(fù)，表現(xiàn)為組織進(jìn)行性壞死，持續(xù)細(xì)胞裂解及進(jìn)展性病灶擴(kuò)大［1］。

糖還原酶(Aldose reductase，AR)廣泛存在于神經(jīng)、肌肉、腦、腎臟、胎盤(pán)、血管、視網(wǎng)膜等組織胞漿中，正常組織內(nèi)AR活性很低，但在全身炎性反應(yīng)、腫瘤、晶狀體炎癥、心肌病、血管內(nèi)皮損傷等患者發(fā)現(xiàn)AR含量增高，抑制其表達(dá)可以減輕炎癥反應(yīng)及組織損傷，減少細(xì)胞凋亡［2-6］。然而AR與脊髓損傷后繼發(fā)炎癥反應(yīng)的相關(guān)性目前尚無(wú)文獻(xiàn)記載，因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)大鼠的脊髓損傷模型探究AR在脊髓損傷前后的表達(dá)變化，觀察其與脊髓損傷的相關(guān)性，以期為脊髓損傷修復(fù)治療提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

1 材料

150只成年雄性SD大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，SPF級(jí))，體重200～270g。隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組，n=50)，脊髓損傷組(SCI組，n=50)和脊髓損傷+醛糖還原酶抑制劑(唐林，即依帕司他)干預(yù)組(ARI組，n=50)。SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德公司提供。RNA提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供。大鼠醛糖還原酶(AR)酶聯(lián)免疫分析試劑盒由上海越研生物科技有限公司提供。大鼠醛糖還原酶抗體購(gòu)自Bioworld科技有限公司。

2 脊髓損傷模型及分組

SCI組和ARI組動(dòng)物模型制備方法如下:大鼠經(jīng)10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后固定在立體定向儀上，切除 T9、T10椎板，壓迫 T9、T10脊髓，壓迫重量為35g，時(shí)間為5min，造成中度胸髓損傷。Sham組只做T9、T10椎板切除術(shù)。ARI組在脊髓損傷后立即給予唐林(ARI)10mg/(kg·d)胃內(nèi)灌注，Sham組和SCI組以相同方法給予等量生理鹽水灌胃作為對(duì)照。術(shù)后軟食飼養(yǎng)，定時(shí)排尿。

3 取材及切片制備

分別于術(shù)后 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(3、12、24、48、72h)切取大鼠脊髓組織(每組每次各5只)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔內(nèi)麻醉后，采用心臟灌流法固定，切取以受傷節(jié)段為中心約8mm長(zhǎng)的脊髓組織，用4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm，備用。每組各時(shí)間點(diǎn)另取5只大鼠，斷頸處死，切取以受傷節(jié)段為中心約8mm長(zhǎng)的脊髓組織，每個(gè)脊髓組織均以受傷節(jié)段為中心橫斷為三等份，置于深低溫冰箱-80℃保存。

4 組織切片

從各組術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每只大鼠的切片中隨機(jī)抽取5張，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組大鼠損傷脊髓組織炎癥反應(yīng)病理變化。

5 免疫組化

從各組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)每只大鼠的切片中隨機(jī)抽取5張，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。以胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，計(jì)算每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

6 雙抗體夾心法測(cè)定AR含量

脊髓組織研磨，離心，取上清液測(cè)定AR蛋白濃度。參照空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即可得到AR含量。

7 RT-PCR法檢測(cè)脊髓組織中AR mRNA表達(dá)

應(yīng)用試劑盒提取各冷凍樣本組織的總RNA，紫外線(xiàn)吸收法測(cè)定RNA純度，變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA。應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:93℃ 2min預(yù)變性，然后按 93℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共做40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 7min延伸。用2-△△ct法進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)比較各組AR mRNA real time PCR拷貝數(shù)的差異。

8 蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)脊髓組織AR含量

取出各組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)每只大鼠低溫保存的脊髓組織，RIPA裂解液提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，顯色。BandScan分析膠片灰度值，甘油酯-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，醛糖還原酶的表達(dá)強(qiáng)度為兩者灰度的比值。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，兩組間比較用方差分析的q檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls，SNK)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織病理學(xué)觀察

病理切片HE染色光鏡觀察顯示，sham組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元形態(tài)完整，組織內(nèi)未見(jiàn)出血、壞死及水腫、變性等表現(xiàn)。SCI組傷后3h傷段脊髓灰質(zhì)內(nèi)有小片狀出血;傷后6h灰質(zhì)中有彌漫性出血灶，灰質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，部分神經(jīng)元死亡，可見(jiàn)核固縮，白質(zhì)疏松水腫;傷后24h出血范圍擴(kuò)大，灰質(zhì)中大量神經(jīng)元死亡，核固縮，中心液化壞死，尼氏體溶解，白質(zhì)中可見(jiàn)大量空泡;傷后48h灰質(zhì)被明顯破壞，損傷中心見(jiàn)壞死空腔形成，并可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);傷后72h灰、白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，組織液化形成空腔，邊緣膠質(zhì)細(xì)胞增生，并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。初始ARI組病理變化與SCI組接近，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，傷后12、24h損傷區(qū)內(nèi)其正常神經(jīng)元數(shù)量多于SCI組;傷后48、72h損傷區(qū)內(nèi)灰、白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞程度及空腔形成亦輕于SCI組，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯(圖1)。

圖1 3組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)組織病理學(xué)改變(HE染色 ×100)(A.sham 組，B.SCI組，C.ARI組)

2 免疫組化結(jié)果

AR表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞在脊髓前角、后角、中央管周?chē)桶踪|(zhì)中均有分布。根據(jù)其形態(tài)和分布規(guī)律推測(cè)主要為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖2)。

圖2 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)脊髓細(xì)胞陽(yáng)性表現(xiàn)(免疫組化 ×400)(A.sham 組，B.SCI組，C.ARI組)

3 AR含量比較

圖3 表明，sham 組 3、12、24、48、72h 脊髓組織中醛糖還原酶含量分別為(10.75±0.47)U/L、(10.61 ±0.44)U/L、(10.62 ±0.55)U/L、(10.92 ±0.49)U/L、(10.57 ±0.52)U/L。與之相比，SCI組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)醛糖還原酶含量顯著增高(P＜0.01)，ARI組各時(shí)間點(diǎn)醛糖還原酶含量較SCI組亦有明顯降低(P＜0.01)。

圖3 Elisa檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織中醛糖還原酶(AR)的含量(SCI組和sham組相比:*P＜0.01;ARI組和SCI組相比:＊＊P＜0.01)

4 RT-PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明AR mRNA在sham組、SCI組和ARI組中均有表達(dá)。以sham組為標(biāo)準(zhǔn)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SCI組和ARI組AR mRNA平均相對(duì)表達(dá)情況見(jiàn)圖4。SCI組與sham組和ARI組相比，AR mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。ARI組與sham組相比沒(méi)有顯著差別(P＞0.05)(圖4)。

圖4 以Sham組為標(biāo)準(zhǔn)不同時(shí)間點(diǎn)AR mRNA real time PCR 2-△△ct值(SCI組和 sham 組相比:*P ＜0.01;ARI組和SCI組相比:＊＊P＜0.01)

5 Western-blot結(jié)果

Western-blot結(jié)果顯示，SCI組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)AR的相對(duì)平均含量顯著高于sham組和ARI組(P＜0.01)，ARI組和sham組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)(圖5)。

圖5 a.Western blot檢測(cè)各組AR蛋白在大鼠脊髓中相對(duì)含量(1、2、3、4、5、6、7 分別為 sham 組 3h、SCI組 3h、24h、72h、ARI組 3h、24h、72h);b.BandScan 分析各組膠片灰度值(AR在各組的相對(duì)含量;SCI組和sham組相比:*P＜0.01;ARI組和SCI組相比:＊＊P＜0.01)

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良Allen法制備大鼠脊髓壓傷模型，并運(yùn)用免疫組化及分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)了脊髓損傷后病灶內(nèi)AR表達(dá)變化及其上游RNA表達(dá)情況。結(jié)果表明脊髓損傷后局部醛糖還原酶RNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)明顯增加，與脊髓損傷的程度有一定的相關(guān)性;并且運(yùn)用醛糖還原酶抑制劑(ARI)可在一定程度上改善脊髓損傷繼發(fā)的病理生理過(guò)程，提示AR可能在SCI后的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮了重要作用。

La Rosa等［7］認(rèn)為SCI后局部產(chǎn)生大量活性氮氧化物及自由基造成起氧化應(yīng)激，加上過(guò)度炎癥反應(yīng)，對(duì)損傷組織造成嚴(yán)重“二次打擊”。局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等，可以增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-kB)的表達(dá)，而它反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步刺激上述細(xì)胞因子的釋放，形成正反饋惡性循環(huán)。而抑制NF-kB的活化可以減輕脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)。目前已公認(rèn)的糖皮質(zhì)激素在SCI急性期對(duì)受傷脊髓的有益作用也證實(shí)了炎癥反應(yīng)在急性SCI中的作用。已有研究表明，AR可介導(dǎo)線(xiàn)粒體膜通透性增加并釋放大量活性氧，在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中起到重要作用［8］。因此我們認(rèn)為AR在SCI繼發(fā)性損傷中的作用可能與其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

此外，本實(shí)驗(yàn)中用到的唐林(依帕司他)是目前已經(jīng)上市的AR抑制劑，主要用于糖尿病相關(guān)神經(jīng)并發(fā)癥的治療，可以改善運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和自覺(jué)神經(jīng)癥狀，且耐受性好［9］。該藥或許可以用于SCI急性期的治療，但需要進(jìn)一步嚴(yán)格設(shè)計(jì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)加以證實(shí)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后局部AR表達(dá)顯著升高，其變化與脊髓損傷成一定程度正相關(guān)，提示AR可能是脊髓繼發(fā)性損傷的因素之一。組織病理學(xué)結(jié)果顯示利用AR抑制劑可減少脊髓損傷局部的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及自由基損傷、減少炎癥反應(yīng)等途徑，尚有待研究。

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