周慶云，趙 潔，田 芳，王東存，孫建平

(甘肅省婦幼保健院，蘭州 730030)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前研究證實［1］:人表皮生長因子受體2(Her-2)在25%～30%的原發(fā)性浸潤性乳腺癌中有基因擴增和蛋白的過度表達。對一般化療方案無效，腫瘤易早期復(fù)發(fā)且患者生存期縮短，靶向治療藥物赫賽汀(Herceptin)自問世并成功用于臨床，已使很多Her-2高表達的患者受益，這提示準確測定Her-2基因狀態(tài)至關(guān)重要。目前臨床檢測Her-2方法有兩種:一是檢測Her-2蛋白的免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical method，IHC)，另一種是檢測Her-2基因的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)。兩種方法各有優(yōu)缺點，相輔相成，美國FDA承認用FISH技術(shù)檢測出Her-2基因的擴增為能進行Herceptin治療的金標(biāo)準［2］。我們應(yīng)用FISH和IHC聯(lián)合檢測乳腺癌患者Her-2基因及Her-2蛋白表達，分析二者之間的差異性和一致性，為乳腺癌患者個體化治療方案的設(shè)計及其預(yù)后的評價提供可靠實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集我院2010年10月至2013年7月乳腺癌標(biāo)本164例，患者均為女性，年齡23～82歲，平均47.5年齡，術(shù)前均未接受放療、化療。所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋。其中浸潤性導(dǎo)管癌149例，浸潤性小葉癌3例，髄樣癌2例，黏液癌4例，小管癌3例，微乳頭狀癌2例，篩狀癌1例。

1.2 方法 用FISH和IHC法分別檢測實驗標(biāo)本中的Her-2基因擴增和Her-2蛋白表達。

1.2.1 熒光原位雜交技術(shù) GLP Her-2/CSP17探針試劑盒(購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)，切片厚度3μm，烤片2 h，室溫下脫蠟，90℃水浴鍋水化20 min，70%乙醇洗后晾干，蛋白酶K 37℃消化，2×SCC 3 min，4%甲醛固定10 min，2×SCC 3 min，梯度乙醇(75%，85%，100%)脫水各3 min，晾干后加探針2μl+8μl，雜交儀 83℃變性，40℃雜交過夜，46℃ ±1℃水浴鍋內(nèi)(2×SCC 7 min，2×SCC 10 min，0.1%NP-40/2 ×SCC 10 min)，70%乙醇提洗3 min，自然晾干后加DAPI復(fù)染液(4℃冰箱放置10 min)，蓋玻片封片后熒光顯微鏡選擇合適通道觀察。

1.2.2 免疫組化技術(shù) 免疫組化單克隆抗體即用型非生物素免疫組化MaxVision TM快速法檢測試劑盒(購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。切片厚度3μm，常規(guī)烤片、脫蠟入純水。組織切片放入pH 6.0的檸檬酸緩沖液中，高壓抗原修復(fù)，用 PBS(pH7.4)充分洗滌后加入一抗4oC冰箱過夜，PBS充分洗片，切片滴加即用型MaxVision TM試劑，室溫孵育15 min。洗滌后加DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 FISH 在40×物鏡下觀察信號，選擇細胞核孤立無重疊，大小一致、核膜完整，綠信號清晰區(qū)域，在100×物鏡下，通過特異的單通道濾光片隨機計數(shù)30個細胞內(nèi)信號。統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=30個細胞核中紅信號總數(shù)/30個細胞核中綠信號總數(shù))。Ratio＜1.8為陰性結(jié)果，提示樣本中無Her-2基因擴增;Ratio＞2.2為陽性結(jié)果，提示樣本中Her-2基因擴增，若兩種信號的比值＞20或眾多信號連接呈簇時，可不用計算，即視為基因擴增;Ratio在1.8～2.2之間時，可以選擇增加計數(shù)細胞至100個，或重做FISH實驗來判斷最終結(jié)果。

1.3.2 IHC 參照美國臨床腫瘤協(xié)會/美國病理學(xué)家學(xué)院Her-2檢測指南評分系統(tǒng)［3］:浸潤性腫瘤細胞無著色為陰性(-)，瘤細胞呈弱且不完整的胞膜著色或＜10% 瘤細胞呈較弱的胞膜染色為弱陽性(+)，≥10% 瘤細胞有較弱但完整的胞膜著色或≤30%瘤細胞呈強且完整的胞膜著色為陽性(++)，＞30%瘤細胞呈較強的完整的胞膜著色為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。FISH和IHC檢測結(jié)果采用配對計數(shù)資料的χ2檢驗比較差異性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Kappa檢驗分析兩者的一致性。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中Her-2基因擴增和蛋白表達(表1)164例浸潤性乳腺癌中，F(xiàn)ISH檢測Her-2基因擴增53例，陽性率為31.70%;按乳腺癌Her-2檢測指南，IHC檢測(-)和(+)為陰性結(jié)果，(++)和(+++)為陽性結(jié)果，本組IHC檢測Her-2蛋白陽性(++～+++)137例，陽性率為83.53%。Her-2蛋白檢出率明顯高于Her-2基因擴增，兩者陽性率有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 IHC法與 FISH法檢測Her-2表達的相關(guān)性(表1和表2) 本組IHC檢測Her-2蛋白陰性(-/+)共27例中有26例無基因擴增，96例(++)中有21例基因擴增，41例(+++)中有30例基因擴增，3組中 IHC和 FISH符合率分別為96.29%、21.87%、73.17%。本組結(jié)果顯示 IHC檢測 27例Her-2蛋白陰性(-/+)的患者和41例(+++)病例與Her-2基因擴增一致性較好(K=0.653，P＜0.05)。IHC檢測96例Her-2蛋白(++)病例中只有21例基因擴增，符合率為21.87%;41例(+++)中有30例基因擴增，符合率為73.17%。兩種方法檢測Her-2基因是否擴增(陰/陽性率比較)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);以 IHC方法檢測Her-2蛋白表達陽性率較高;兩種檢測方法的吻合度一般(Kappa=0.479，P＜0.05)。

表1 Her-2蛋白表達水平與Her-2基因擴增情況［n(%)］

表2 IHC(++)和(+++)與FISH檢驗結(jié)果比較［n(%)］

3 討論

Her-2基因(又稱Her-2/neu或Her-2基因)是人類原癌基因，定位于人染色體17q21。在乳腺癌的發(fā)病、發(fā)展、預(yù)后和選擇使用Herceptin生物靶向治療中有重要意義，Her-2基因過表達的乳腺癌患者其癌細胞侵襲性強，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對化療耐受，對內(nèi)分泌治療效果也不理想，其預(yù)后也較差［4］。2002年美國FDA批準了分子靶向藥物Herceptin在臨床治療中的應(yīng)用，它對于乳腺癌中具有Her-2基因擴增的患者具有良好的治療效果，可以大大提高其生存期，而對Her-2基因無擴增患者治療則是無效的。且其費用昂貴，又存在心血管疾病的潛在風(fēng)險［5］。因而無論是臨床醫(yī)生還是患者對于該藥物的選擇都非常慎重。因此，準確檢測Her-2基因及其蛋白表達顯得極為關(guān)鍵。

目前，臨床診斷常用IHC檢測Her-2蛋白和FISH檢測Her-2基因兩種方法。IHC由于操作簡單，費用低廉，可重復(fù)性好，對標(biāo)本要求不高，因此在臨床上被廣泛應(yīng)用。但其定量性不強，從組織固定、抗原修復(fù)、染色切片、判讀、不同批號抗體之間的差異等都影響檢測結(jié)果，17號染色體的非整倍體還會使檢測出現(xiàn)假陽性［6］。FISH方法因其高度敏感性和特異性及高度重復(fù)性和可靠性在Her-2基因檢測中被當(dāng)作金標(biāo)準用于Her-2基因檢測。但FISH結(jié)果也會受到一些因素的影響，如標(biāo)本固定時間長，烤片溫度過高，蛋白消化不當(dāng)，變性溫度差異等，都會造成熒光信號減弱或無信號。鑒于上述這些影響因素，對IHC和FISH檢測Her-2狀態(tài)一致性的研究具有重要的臨床意義。

本研究中，27例IHC陰性的病例中，F(xiàn)ISH呈陰性者占96.29%(26/27)，兩者結(jié)果具有較高一致性。既往研究發(fā)現(xiàn)［7］IHC-/+的病理與FISH檢測的符合率可達95%以上，與本研究結(jié)果一致。但在96例IHC(++)患者中，F(xiàn)ISH呈陽性者只占21.87%(21/96)，提示與FISH檢測結(jié)果的一致性較差，被認為不確定的結(jié)果，與文獻報道［8］IHC(++)的乳腺癌FISH陽性10% ～25%的結(jié)果一致。本研究中IHC檢測Her-2蛋白表達(+++)者中只有73.17%表現(xiàn)為 Her-2基因擴增，與既往研究［9-10］IHC(+++)的病例與FISH檢測陽性的符合率達90%以上國內(nèi)外文獻報道有一定差距。而與國內(nèi)王曉蘭等［11］報道的68%的檢測符合率相近，依據(jù)上述結(jié)果提示IHC與FISH兩種方法的檢測結(jié)果存在較大的差異。Her-2蛋白表達為(++/+++)的樣本中，仍然有一部分表現(xiàn)為Her-2基因無擴增。

有研究表明，對于FISH檢測陽性患者，IHC檢測陰性患者，其Herceptin治療后的生存是與FISH檢測陽性、IHC檢測陽性患者的生存期一致，而FISH法檢測陰性、IHC檢測陽性患者，治療后的生存與FISH法檢測陰性、IHC檢測陰性患者的生存期一致。這說明IHC檢測存在假陽性，目前研究認為主要與17號染色體非整倍體有關(guān)［12］。本組研究IHC(++)患者中，F(xiàn)ISH呈陽性者只占21.87%，是否因與17號染色體非整倍體有關(guān)出現(xiàn)了假陽性，或是因?qū)嶒灹鞒?，檢測結(jié)果質(zhì)控欠規(guī)范，造成IHC與FISH兩種方法的檢測結(jié)果存在較大的差異，還有待于進一步研究。

綜上所述，采用IHC檢測Her-2蛋白表達時，可作為臨床治療是否應(yīng)用Herceptin的初篩。初篩結(jié)果中IHC(-/+)的病例Her-2基因幾乎無擴增，而無需再做FISH檢測。而Her-2蛋白表達為(++)時，有必要進一步進行Her-2基因擴增的檢測，Her-2蛋白表達為(+++)時可建議進行Her-2基因擴增的檢測，來確定臨床治療是否應(yīng)用Herceptin，為患者分子靶向治療和預(yù)后評估提供實驗依據(jù)。

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