李學(xué)慧，代麗麗，董 玫，張 霞，謝 磊，張紅真△

（河北醫(yī)科大學(xué)：1.第一醫(yī)院婦產(chǎn)科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北石家莊050011）

目前化療已成為治療中、晚期惡性腫瘤的重要方法，但是現(xiàn)有的絕大多數(shù)化療藥物細(xì)胞毒作用大、組織特異性差，易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題一直困擾著臨床醫(yī)生。因此，尋找毒副作用低，抗耐藥性強(qiáng)，組織特異性強(qiáng)的化療藥物已成為國(guó)內(nèi)、外研究的熱點(diǎn)之一。自天然產(chǎn)物紫杉醇作為抗癌藥物應(yīng)用到臨床以來(lái)，與其結(jié)構(gòu)相似藥物的開(kāi)發(fā)已愈來(lái)愈受到重視。有研究報(bào)道，日本粗榧果實(shí)中分離出的二萜類化合物kayadiol對(duì)人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞增殖有抑制作用［1－2］。目前對(duì)二萜類化合物的抑瘤活性的研究比較少見(jiàn)，關(guān)于kayadiol抑制細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究更少見(jiàn)報(bào)道。本研究將二萜類化合物kayadiol作用于人子宮內(nèi)膜癌HEC－1細(xì)胞株，觀測(cè)其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)影響，并探討其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC－1由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)教室提供。實(shí)驗(yàn)用化合物kayadiol由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室提供。四甲基偶氮唑鹽（MTT）和順鉑（cisplatin）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（11684795910）購(gòu)自德國(guó)Roche公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）購(gòu)自美國(guó)Biotec公司；鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）多克隆抗體、鼠抗人 Bax多克隆抗 體 （sc－7480）、羊抗鼠IgG紅外熒光二抗及β－actin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；溴化乙錠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 體外抑瘤實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEC－1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，接種于96孔板，每孔100mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含有不同濃度kayadiol（1、10、100、μmol／L）的培養(yǎng)基，并設(shè)二甲基亞砜（DMSO）溶劑對(duì)照組（1、10、100μmol／L的 DMSO）、順鉑對(duì)照組（分別為1、10、100μmol／L的順鉑），每孔100μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44h后，向各培養(yǎng)孔中加入10mL MTT（5mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）于492nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。生存率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.2 凋亡細(xì)胞原位標(biāo)記與半定量分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC－1細(xì)胞，接種于8孔培養(yǎng)板，每孔100μL（含1×104個(gè)細(xì)胞），分別加入終濃度0.1%DMSO和終濃度為10μmol／L的kayadiol 100μL，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24h；棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，每孔100μL，于室溫培養(yǎng)1h；棄液體，加入通透液每孔100μL，冰浴2min；棄液體，溶劑對(duì)照組與kayadiol組加入TUNEL溶液，每孔80μL。溶劑對(duì)照組，加入熒光標(biāo)記的三磷酸脫氧尿苷（dUTP）液，每孔80μL，加蓋玻片在暗濕盒中反應(yīng)1h。棄液體，熒光顯微鏡下觀察，可以使用的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450～500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515～565nm（綠色熒光）。結(jié)果根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況。每張切片拍攝5個(gè)陽(yáng)性視野，每視野計(jì)數(shù)正常細(xì)胞數(shù)和帶熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)，以陽(yáng)性細(xì)胞所占正常細(xì)胞的百分比作為細(xì)胞凋亡率（AR）。

1.2.3 Western blot法檢測(cè) 收集溶劑對(duì)照組、順鉑對(duì)照組（終濃度為10μmol／L的順鉑作用48h）和kayadiol組（終濃度為10μmol／L kayadiol作用48h）HEC－1細(xì)胞，按蛋白提取操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）2h，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用含脫脂奶粉的無(wú)蛋白（TBS）封閉緩沖液封閉1h后，分別加入一抗Bax抗體（1∶500）和Caspase－3抗體（1∶700），4℃過(guò)夜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1h，雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描顯像，設(shè)β－Actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。多組間比較用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Kayadiol、順鉑對(duì)HEC－1細(xì)胞增殖的影響 Kayadiol和順鉑對(duì) HEC－1細(xì)胞的增殖顯示強(qiáng)的抑制活性。1、10、100 μmol／L的順鉑處理HEC－1細(xì)胞后，其生存率分別為86.04%、66.33%、37.04%，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系，與溶劑對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；kayadiol組1、10、100 μmol／L kayadiol處 理 HEC－1 細(xì) 胞 后，其 生 存 率 分 別 為69.87%、39.31%、2.76%，并呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系，與溶劑對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。順鉑和kayadiol作用后HEC－1細(xì)胞生存率比較，見(jiàn)表1。

表1 順鉑和kayadiol作用后HEC－1細(xì)胞生存率比較（%）

圖1 各組HEC－1細(xì)胞凋亡情況

2.2 Kayadiol對(duì) HEC－1細(xì)胞凋亡的影響 10μmol／L的kayadiol處理HEC－1細(xì)胞24h后，TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，Kayadiol可明顯誘導(dǎo)HEC－1細(xì)胞的凋亡，具有時(shí)間依賴關(guān)系，溶劑對(duì)照組和Kayadiol組12、24h的 HEC－1細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。熒光顯微鏡下觀察各組HEC－1細(xì)胞凋亡情況，見(jiàn)圖1。

2.3 Kayadiol對(duì)HEC－1細(xì)胞中Bax和Caspase－3蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果提示，經(jīng)kayadiol處理48h后的HEC－1細(xì)胞內(nèi)的Bax、caspase－3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與順鉑對(duì)照組接近，見(jiàn)圖2。

表2 溶劑對(duì)照組和Kayadiol組12、24h的HEC－1細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表2 溶劑對(duì)照組和Kayadiol組12、24h的HEC－1細(xì)胞凋亡率比較（±s）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與溶劑對(duì)照組比較。

組別2.40±1.20 3.06±0.27 Kayadiol組 40.16±6.84＊ 86.88±6.00 12h 24h溶劑對(duì)照組＊＊

圖2 各組HEC－1細(xì)胞48h后Bax、Caspase－3蛋白表達(dá)

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)為主，放療為輔，化療主要用于特殊病理類型、細(xì)胞分化差或晚期的和復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌，旨在降低內(nèi)膜癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［3－4］，提高總體生存率。近年來(lái)，具有高危因素的子宮內(nèi)膜癌術(shù)后同步放、化療也開(kāi)始應(yīng)用［5－7］，同時(shí)，國(guó)外開(kāi)展了多項(xiàng)針對(duì)早期高危子宮內(nèi)膜癌術(shù)后輔助化療預(yù)防復(fù)發(fā)的隨機(jī)對(duì)照研究，使早期子宮內(nèi)膜癌化療成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

二萜類化合物中紫杉醇、雷公藤內(nèi)酯醇等對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖都有抑制作用［8－11］。kayadiol是從日本榧樹(shù)中分離出的二萜類化合物，潘永梅等［1］報(bào)道kayadiol對(duì)人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞增殖也有抑制活性。順鉑是廣譜抗癌藥，為鉑的金屬絡(luò)合物，作用似烷化劑，主要作用靶點(diǎn)為DNA，是被證明在鉑類藥物中最有效的藥物。本實(shí)驗(yàn)以kayadiol為研究對(duì)象，以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，用MTT比色法檢測(cè)其對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC－1細(xì)胞株體外生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果顯示經(jīng)1、10、100 μmol／L 3種不同濃度的kayadiol作用 HEC－1細(xì)胞后，HEC－1細(xì)胞株生存率與溶劑對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，以濃度100μmol／L顯著（P＜0.01），強(qiáng)于順鉑抑瘤效果。

細(xì)胞增殖與凋亡平衡的失調(diào)和多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系［12－14］。凋亡抑制基因過(guò)高表達(dá)、促凋亡基因突變或缺失，都可使腫瘤發(fā)生率增加［15］。本實(shí)驗(yàn)用TUNEL法檢測(cè)了kayadiol處理12、24h后HEC－1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有時(shí)間依賴關(guān)系，提示kayadiol具有明顯誘導(dǎo)HEC－1細(xì)胞發(fā)生凋亡的活性。Bax蛋白是Bcl－2家族的一種前凋亡蛋白，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，一旦受到凋亡因子的誘導(dǎo)，可以向線粒體轉(zhuǎn)位，通過(guò)寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，或者開(kāi)啟線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔，導(dǎo)致線粒體中的凋亡因子釋放，從而激活Caspase蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶［16］，其中Caspase－3可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白而引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用Western blot法檢測(cè)kayadiol處理48h后的HEC－1細(xì)胞中的Caspase－3和Bax蛋白水平，結(jié)果顯示：經(jīng)kayadiol處理后，HEC－1細(xì)胞內(nèi)的Caspase－3和Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示kayadiol對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的抑制作用有可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)kayadiol對(duì)HEC－1細(xì)胞的增殖具有強(qiáng)的抑制作用，呈時(shí)效和量效關(guān)系，其抑制HEC－1細(xì)胞增殖是通過(guò)上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)和激活Caspase－3而引起腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一個(gè)由多信號(hào)誘導(dǎo)、多基因調(diào)控和多因子參與的過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的僅僅是誘導(dǎo)凋亡的通路之一，kayadiol是否還通過(guò)其他途徑誘導(dǎo)凋亡需要進(jìn)一步研究。

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