李迪諾 王玉彬 王貴軍 馬艷梅 金 玥 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科，遼寧 錦州 121001)

恩度作為國(guó)產(chǎn)抗血管生成藥物對(duì)腫瘤血管生成具有抑制作用〔1〕，被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的輔助靶向治療〔2〕，具有多靶點(diǎn)療效可靠、副作用小、為細(xì)胞殺傷藥物增敏等優(yōu)點(diǎn)〔3〕。順鉑作為細(xì)胞毒性藥物，在惡性腫瘤治療中療效被廣泛認(rèn)可〔4〕。本研究將兩種藥物相結(jié)合應(yīng)用于裸鼠胃癌種植瘤，觀察對(duì)細(xì)胞凋亡與腫瘤微血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要?jiǎng)游锱c試劑 Balb/c裸鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于遼寧醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司;Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、Marker等均購(gòu)自TaKaRa公司;PV二步法免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司;兔抗人 ID1、VEGF、CD34單克隆抗體及二抗IgG-HRP、β-actin均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。重組人血管內(nèi)皮抑制素恩度、購(gòu)自于煙臺(tái)先聲麥得津公司，順鉑購(gòu)自錦州九泰藥業(yè);引物序列:ID1:正鏈5'-CAAGTGGCCAGAGGCATGCACTT-3'，負(fù) 鏈 5'-GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG-3';VEGF:正鏈5'-GAAGTGGTGAAGTTCAT-GGATGTC-3'，負(fù)鏈 5'-CGATCGTTCTGTATCACTCTTTCC-3'。引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 人胃癌裸鼠種植瘤 用含有10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱里常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至80%培養(yǎng)瓶面積時(shí)，以0.25%胰酶37℃消化1 min，倒去胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打至單細(xì)胞懸液，分裝傳代。傳代3次，將SGC-7901細(xì)胞懸液種植于32只裸鼠腋窩皮下。

1.3 分組 Balb/c荷瘤裸鼠隨機(jī)分四組，每組8只，成瘤直徑0.8 cm后采用恩度及順鉑分別干預(yù):對(duì)照組不處理，實(shí)驗(yàn)組1予5 mg/kg順鉑干預(yù);實(shí)驗(yàn)組2予5 mg/kg恩度干預(yù);實(shí)驗(yàn)組3予5 mg/kg恩度聯(lián)合5 mg/kg順鉑干預(yù)。恩度隔1 d瘤周皮下給藥一次，順鉑隔3 d腹腔給藥一次，療程4 w，開(kāi)始治療后每日觀察裸鼠活動(dòng)、攝食及飲水情況，每周用稱體重。

1.4 取材 治療4 w后，停藥1 w，用水合氯醛麻醉處死裸鼠。取出腫瘤組織，檢測(cè)體積及稱重。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 瘤組織蠟塊包埋，切片，脫蠟，抗原修復(fù)。一抗兔抗人CD34用PBS以1∶50稀釋，同時(shí)設(shè)PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。二抗羊抗兔IgG-HRP以1∶200稀釋。DAB顯色，樹(shù)膠封片觀察。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，證實(shí)胃癌細(xì)胞表達(dá)CD34蛋白，微血管密度(MVD)采用Weidner微血管計(jì)數(shù)方法。

1.6 RT-PCR測(cè)定ID1、VEGF基因表達(dá) 各組新鮮冰凍組織標(biāo)本按照RT-PCR試劑盒操作步驟，總RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)之后，72℃再延伸 8 min。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳分離，紫外分析儀觀察后攝片。Lab Works軟件進(jìn)行凝膠成像分析，測(cè)定陽(yáng)性電泳條帶的平均灰度值，計(jì)算各樣本目的基因與β-actin電泳條帶的平均灰度值比值，作為其相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western印跡免疫印跡檢測(cè)ID1、VEGF蛋白的表達(dá) 各組新鮮冰凍組織標(biāo)本，預(yù)冷PBS洗3次后加入400 μl裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min，4℃ 14 000 r/min×5 min，提取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，含5%BSA的TBST室溫封閉1 h，加入 ID1、VEGF 與 β-actin 抗體(1∶500)，4℃ 搖床過(guò)夜，加入二抗(1∶1 000)雜交，洗膜后顯色。

1.8 透射電鏡檢測(cè)瘤組織凋亡情況 經(jīng)4%戊二醛固定樣品，0.1 mol/L PBS清洗 3次，每次 15 min;鋨酸固定 2 h;0.1 mol/L PBS清洗3次，每次15 min。分別30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，每次20 min，100%兩次，每次30 min。包埋劑與丙酮混合液(1∶1)37℃浸透1 h，包埋劑與丙酮混合液(3∶1)浸透，37℃過(guò)夜;純包埋劑37℃浸透24 h后包埋，60℃聚合48 h。Leica UCT超薄切片機(jī)切片，日立H-7500透射電鏡觀察凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及四格表確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況的變化 裸鼠成瘤前飲食、飲水及活動(dòng)情況良好，四組間體重?zé)o差異。用藥后順鉑組裸鼠活動(dòng)明顯減少，飲食量下降，體重下降，持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組、恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組裸鼠體重一直持續(xù)增長(zhǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(表1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，順鉑組裸鼠體重較其余各組裸鼠體重明顯減少(P＜0.05)，對(duì)照組與恩度組裸鼠體重之間比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.53)，但是恩度聯(lián)合順鉑組裸鼠體重分別與對(duì)照組和恩度組之間裸鼠體重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 裸鼠體重量表(±s，n=8，g)

表1 裸鼠體重量表(±s，n=8，g)

組別 初始體重 結(jié)束體重恩度聯(lián)合順鉑組18.26±0.35 19.75±0.33恩度組 18.17±0.73 22.50±0.59順鉑組 17.99±0.41 14.21±0.83對(duì)照組18.62±0.74 21.98±0.91

2.2 裸鼠腫瘤體積的變化 四組裸鼠皮下移植瘤體積隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行逐漸增長(zhǎng)，對(duì)照組體積增長(zhǎng)迅速，而順鉑組、恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組體積增長(zhǎng)緩慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，恩度聯(lián)合順鉑組、恩度組、順鉑組、對(duì)照組裸鼠體積依次為(0.29±0.13)、(0.52±0.29)、(0.60±0.31)、(1.29 ±0.65)cm3。各組腫瘤體積之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032＜0.05)。其中，對(duì)照組分別與順鉑組、恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而順鉑組、恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果表明恩度可以抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，但是沒(méi)有消瘤作用。

2.3 裸鼠腫瘤的質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，恩度聯(lián)合順鉑組、恩度組、順鉑組、對(duì)照組裸鼠腫瘤質(zhì)量依次為(0.43±0.25)、(0.84±0.33)、(0.79±0.26)、(1.81±0.75)g。對(duì)照組分別與順鉑組、恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而順鉑組、恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 免疫組化結(jié)果 各組之間微血管密度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)(圖1)，恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組腫瘤血管的抑制作用較明顯，兩組MVD分別為11.38±1.25和10.93±1.54，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而分別與順鉑組(16.17±1.33)、對(duì)照組(23.73±2.40)MVD比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，順鉑組與對(duì)照組之間MVD比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組ID1和VEGF mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05);而順鉑組和對(duì)照組之間ID1和VEGF mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)(圖2)。

2.6 Western印跡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組ID1和VEGF蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);而順鉑組和對(duì)照組之間ID1和VEGF蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖3。

2.7 裸鼠腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 在透射電鏡下觀察，恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組的裸鼠腫瘤細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)有凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為可見(jiàn)核碎裂塊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象，線粒體髓樣化(圖4)。在對(duì)照組和順鉑組內(nèi)并未見(jiàn)到細(xì)胞凋亡情況，而是發(fā)現(xiàn)大量變性壞死的細(xì)胞，表現(xiàn)為線粒體大部分嵴消失，線粒體膜缺損，線粒體髓樣化，胞質(zhì)水腫有變性壞死，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象(圖4)。結(jié)果顯示恩度不僅可以抑制腫瘤新生血管的生成，還通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而直接抑制部分腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的作用。

圖1 各組微血管密度比較(胞質(zhì)中的棕色顆粒為高表達(dá)的CD34蛋白(×100)

3 討論

恩度是我國(guó)自主研發(fā)的多靶點(diǎn)抗腫瘤血管生成藥物。恩度大量的臨床前與臨床試驗(yàn)肯定了恩度作為新型靶向抗腫瘤藥物的有效性與安全性〔5〕。恩度的優(yōu)勢(shì)有〔6～8〕:靶點(diǎn)直接暴露于血液中，便于藥物直接作用;靶點(diǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生抗藥性;無(wú)需考慮腫瘤組織學(xué)特異性;可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移;有下游放大效應(yīng);不良反應(yīng)相對(duì)較少。恩度與放、化療聯(lián)合具有協(xié)同作用:(1)可使腫瘤區(qū)血管生成正?；?，組織間高壓減輕，利于化療藥向腫瘤區(qū)輸送。(2)放、化療所致局部腫瘤區(qū)缺氧可促VEGF表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞抵抗放、化療的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制;而聯(lián)用恩度將預(yù)防此繼發(fā)保護(hù)效應(yīng)，使治療反應(yīng)增敏。

順鉑是細(xì)胞毒性藥物，抗腫瘤作用顯著〔9〕。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)各組均表現(xiàn)為瘤體減小，表明細(xì)胞殺傷與抑制血管生成均能夠抑制裸鼠胃癌種植瘤的生長(zhǎng);但實(shí)驗(yàn)各組間比較無(wú)明顯差異，可能由于腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間以及藥物作用時(shí)間和濃度造成差異無(wú)顯著性。單用順鉑組的裸鼠體重下降非常明顯，裸鼠消瘦，而單用恩度組和恩度與順鉑聯(lián)合組的裸鼠體重是逐漸增長(zhǎng)的，可見(jiàn)恩度可以降低化療藥引起的裸鼠體重下降等副作用。MVD免疫組化結(jié)果顯示，恩度與聯(lián)合組對(duì)MVD抑制效果明顯，順鉑組與對(duì)照組抑制效果明顯低于恩度與聯(lián)合組，表明恩度具有明顯的血管抑制效果。有文獻(xiàn)證實(shí)恩度對(duì)微血管密度的抑制作用是通過(guò)抑制VEGF上游因子ID1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，本研究結(jié)果顯示與上述理論相符，而順鉑對(duì)該因子的作用效果不顯著。透射電鏡結(jié)果顯示恩度作用發(fā)現(xiàn)后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;而在對(duì)照組和順鉑組內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)確實(shí)的凋亡現(xiàn)象，可以進(jìn)一步認(rèn)為恩度不僅可以抑制腫瘤新生血管的生成，還通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而直接抑制部分腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的作用。

綜上所述，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)恩度可以通過(guò)降低ID1的表達(dá)抑制血管的新生，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的效果，為胃癌的新輔助化療提供了一種新的思路。

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