樓旭丹 汪海東 陳 芳 夏世金 孫 皎 (復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200040)

白細(xì)胞介素-17(IL-17)是新發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞因子，由初始CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化的新型效應(yīng)性輔助性T細(xì)胞(Th17)產(chǎn)生〔1〕。早期基于小鼠的研究指出Th17細(xì)胞是自身免疫性疾病發(fā)生時(shí)的一種病理性細(xì)胞，可伴隨IL-17在血清及局部組織中的表達(dá)增加。IL-17與特異性受體(IL-17R)結(jié)合后通過(guò)磷酸肌醇3肌酶/蛋白激酶B/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(PI3K-Akt-ERK)依賴(lài)途徑、絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途徑等炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路活化多種細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)〔2〕，因此被認(rèn)為與組織炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病密切相關(guān)。本文前期工作證實(shí)在自身免疫性糖尿病小鼠發(fā)病初期，IL-17蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，而且IL-17可加速自身免疫性非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰島炎和糖尿病的發(fā)生〔3〕，但I(xiàn)L-17在糖尿病大血管病變患者血清中的表達(dá)變化尚未可知。本研究旨在探討IL-17與T2DM大血管病變之間的相關(guān)性，為臨床診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 T2DM組162例(男75例，女87例)，均為我院2011～2012年住院及門(mén)診患者，符合1999年世界衛(wèi)生組織WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡38～67〔平均(58.84±10.51)〕歲，根據(jù)是否合并糖尿病血管病變，分為大血管病變組90例和無(wú)血管病變組72例。大血管病變?cè)\斷至少應(yīng)符合以下任1條標(biāo)準(zhǔn):有心絞痛或心肌梗死病史，經(jīng)動(dòng)態(tài)心電圖和超聲心動(dòng)圖或經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診的臨床冠心病;有腦血管意外病史，頭顱CT或MRI掃描明確有缺血病灶;多普勒超聲檢查可見(jiàn)頸或雙下肢動(dòng)脈血管壁硬化斑塊或血栓形成或動(dòng)脈廣泛不規(guī)則狹窄;下肢缺血性臨床表現(xiàn)(間歇性跛行、缺血性疼痛、壞疽等)。正常對(duì)照組68例(男31例，女37例)，為同期查體健康者，年齡41～65〔平均(56.19±9.06)〕歲，空腹及餐后2 h血糖均正常。組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。排除糖尿病急性并發(fā)癥及其他可導(dǎo)致糖代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病;嚴(yán)重心、腦、血管并發(fā)癥，包括6個(gè)月內(nèi)有急性心肌梗死、血管成形術(shù)及有應(yīng)激史(外傷、手術(shù)、精神刺激等);肝、腎功能不全或合并急、慢性感染者;嚴(yán)重原發(fā)性疾病，如惡性腫瘤、自身免疫性疾病;近期使用羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑、降糖藥物或胰島素治療者。

1.2 臨床資料 對(duì)研究對(duì)象測(cè)量身高、體重，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)〔BMI=體重(kg)/身高(m)2〕，測(cè)量坐位，收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)，2次取平均值。所有受試者均在基礎(chǔ)狀態(tài)下普通飲食，禁食8～12 h后空腹靜脈采血5 ml，測(cè)定空腹血糖(FPG)(葡萄糖氧化酶法)、糖化血紅蛋白(HbA1c)(親和層析比色法)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)(顆粒增強(qiáng)免疫沉淀法)，Olympus AU-400生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，100 g饅頭餐后2 h采血測(cè)定血糖(2 h PG)(葡萄糖氧化酶法)。

1.3 方法

1.3.1 炎癥因子檢測(cè) 研究對(duì)象在清晨空腹抽取靜脈血時(shí)，另留一管5 ml血，常規(guī)分離血清(2 500 r/min，15 min)后立即放置于-20℃密封冷凍保存待測(cè)。檢測(cè)前血清自然融化，期間不曾凍融。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-17表達(dá)水平，試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，板內(nèi)變異系數(shù)＜10%，板間變異系數(shù)＜15%，實(shí)驗(yàn)操作及質(zhì)量控制均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)完成后30 min內(nèi)用美國(guó)Bio-Rad公司680酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣本中IL-17濃度。

1.3.2 頸動(dòng)脈超聲多普勒檢查 采用二維超聲測(cè)定頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)。患者取臥位，頸部側(cè)伸45°，用美國(guó)西門(mén)子公司sequoia全身彩超儀4～6 MHz高分辨率探頭，由同一檢查者進(jìn)行操作，掃描雙側(cè)頸動(dòng)脈起始部至頸總動(dòng)脈分叉1 cm處最大的IMT，明確有無(wú)頸動(dòng)脈IMT和粥樣斑塊形成等改變。兩側(cè)取平均值，以IMT≥0.9 mm者為頸動(dòng)脈增厚〔4〕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，三組間比較用單因素方差分析。各指標(biāo)間關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，多因素分析采用多元逐步回歸法，非正態(tài)分布資料比較時(shí)取對(duì)數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)指標(biāo)比較 大血管病變組和無(wú)血管病變組SBP、FPG、2 h PG、HbA1c、hs-CRP、TC、TG、LDL-C 均高于正常對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，大血管病變組 SBP和 hs-CRP顯著高于無(wú)血管病變組(P＜0.01);BMI和HDL-C僅在大血管病變組和正常對(duì)照組比較時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;年齡、病程和DBP組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。血清IL-17表達(dá)水平在正常對(duì)照組、無(wú)血管病變組和大血管病變組中依次逐漸升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 以有無(wú)頸動(dòng)脈增厚分組比較 對(duì)T2DM大血管病變患者進(jìn)行IMT測(cè)定，以有無(wú)頸動(dòng)脈增厚對(duì)IL-17水平變化進(jìn)行比較，IMT在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，頸動(dòng)脈增厚組IL-17水平明顯高于無(wú)頸動(dòng)脈增厚組(P＜0.05)，組間性別、年齡構(gòu)成無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組指標(biāo)比較(±s)

表1 各組指標(biāo)比較(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與無(wú)血管病變組比較:3)P＜0.01

指標(biāo) 正常對(duì)照組(n=68)無(wú)血管病變組(n=72)大血管病變組(n=90)男/女(n)31/37 33/39 42/48年齡(歲) 56.19±9.06 55.63±8.62 59.98±10.97病程(年) - 8.19±4.18 10.82±4.32 BMI(kg/m2) 21.45±3.12 23.86±3.45 26.14±6.431)SBP(mmHg) 117.63±14.78 130.31±13.602)141.42±16.832)3)DBP(mmHg) 77.29±9.66 79.38±11.24 81.11±9.88 FPG(mmol/L) 4.91±1.02 8.13±2.952) 8.02±2.692)2 h PG(mmol/L) 5.84±1.28 11.94±2.802) 12.61±3.362)HbA1c(%) 5.43±0.29 8.98±1.852) 9.24±1.872)hs-CRP(mg/L) 0.72±0.54 1.29±0.682) 2.41±1.192)3)TC(mmol/L) 4.43±0.98 5.16±1.171) 5.37±1.172)TG(mmol/L) 1.60±0.86 2.43±1.292) 2.54±1.372)LDL-C(mmol/L) 2.82±1.00 3.59±0.852) 3.85±1.132)HDL-C(mmol/L) 1.06±0.33 0.99±0.36 0.84±0.222)IL-17(pg/ml) 20.19±6.13 33.26±4.382) 42.49±4.892)3)

表2 無(wú)頸動(dòng)脈增厚組與有頸動(dòng)脈增厚組參數(shù)比較(±s)

表2 無(wú)頸動(dòng)脈增厚組與有頸動(dòng)脈增厚組參數(shù)比較(±s)

與無(wú)頸動(dòng)脈增厚組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

指標(biāo) 無(wú)頸動(dòng)脈增厚組(n=39)有頸動(dòng)脈增厚組(n=51)男/女(n)18/21 24/27年齡(歲) 56.33±10.14 61.19±10.41 IMT(mm) 0.85±0.09 1.03±0.112)IL-17(pg/ml) 28.82±5.99 39.50±4.171)

2.3 IL-17與其他指標(biāo)相關(guān)性分析 大血管病變組IL-17水平與 BMI(r=0.389，P ＜0.05)、2 h PG(r=0.306，P ＜0.05)、hs-CRP(r=0.525，P ＜0.05)、TG(r=0.496，P ＜0.01)、LDL-C(r=0.617，P ＜0.01)呈正相關(guān)，與 HDL-C(r=-0.517，P ＜0.01)呈負(fù)相關(guān)，而與年齡、病程、血壓、FPG、HbA1c和TC無(wú)明顯相關(guān)性。無(wú)血管病變組IL-17與hs-CRP(r=0.431，P＜0.05)、LDLC(r=0.679，P ＜0.01)呈正相關(guān)，與 HDL(r=-0.470，P ＜0.05)呈負(fù)相關(guān)，而與其他指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。正常對(duì)照組IL-17與各指標(biāo)均無(wú)相關(guān)關(guān)系。

2.4 多因素逐步回歸分析 以有無(wú)大血管病變(設(shè)有大血管病變?yōu)?，無(wú)大血管病變?yōu)?)為應(yīng)變量，IL-17、年齡、病程、SBP、DBP、BMI、FPG、2 h PG、HbA1c、hs-CRP、TC、TG、LDL-C、HDL-C為自變量，用多元逐步回歸篩選變量，按α=0.05的水平，IL-17(偏回歸系數(shù)0.261，P=0.028)、hs-CRP(偏回歸系數(shù)0.475，P=0.007)和 LDL-C(偏回歸系數(shù) 0.156，P=0.011)依次進(jìn)入方程。根據(jù)逐步回歸結(jié)果，可以認(rèn)為影響T2DM大血管病變的主要因素為IL-17、hs-CRP和HDL-C。

3 討論

糖尿病是一種以糖、脂代謝紊亂為主要特征的臨床綜合征。循證醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)，無(wú)論是1型糖尿病(T1DM)或是T2DM，高血糖均可顯著促發(fā)微血管并發(fā)癥如糖尿病腎病、神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變的發(fā)生，以及大血管并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和中風(fēng)的發(fā)生〔5〕。氧化應(yīng)激、脂質(zhì)異常、糖基化終產(chǎn)物生成及高糖毒性被認(rèn)為是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的高危因素，而通過(guò)調(diào)節(jié)因子增強(qiáng)炎癥信號(hào)表達(dá)觸發(fā)的血管炎癥則是涉及其中的主要事件〔6〕。已有研究表明，單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、CRP、IL-6 等均與炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路激活、不穩(wěn)定斑塊形成致血管功能障礙有關(guān)，尤其T細(xì)胞免疫參與了糖尿病致動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程〔7〕。Th17是一種新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子。在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，Th17細(xì)胞參與了自身免疫性糖尿病的發(fā)生，減少胰島局部Th17細(xì)胞的數(shù)量可以使胰島β細(xì)胞的破壞減少〔8〕。同時(shí)，有研究證明在T1DM胰島炎發(fā)生的病理過(guò)程中，IL-17和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增加〔9〕。T2DM在本質(zhì)上有類(lèi)似于T1DM的發(fā)生機(jī)制，是一種免疫相關(guān)慢性炎癥性疾病。已有研究表明，在初診T2DM患者胰島素強(qiáng)化治療前后血清IL-17持續(xù)處于高水平，提示IL-17可能參與T2DM的發(fā)生發(fā)展〔10〕。

IL-17能上調(diào)或協(xié)同基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、IFN-γ及CRP表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性疾病〔11〕。本課題組曾以高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM模型，通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)IL-17表達(dá)于主動(dòng)脈內(nèi)膜，以糖尿病組內(nèi)膜染色最為顯著，病變范圍更加廣泛;進(jìn)一步檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈IL-17蛋白及mRNA表達(dá)水平，均提示IL-17參與T2DM大血管病變的炎癥反應(yīng)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上檢測(cè)T2DM患者血清IL-17水平，結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。2003年的歐洲高血壓治療指南將頸動(dòng)脈IMT≥0.9 mm確定為內(nèi)膜中層增厚，國(guó)內(nèi)有學(xué)者亦以IMT≥0.9 mm為增厚標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)為頸動(dòng)脈IMT可以作為預(yù)測(cè)糖尿病患者心血管疾病的“標(biāo)志”〔12〕。本實(shí)驗(yàn)也表明IL-17與糖尿病大血管病變密切相關(guān)。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IL-17 與 BMI、2 h PG、hs-CRP、TG、LDL-C呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)?？梢?jiàn)，在自身免疫性糖尿病患者體內(nèi)，IL-17等促炎性指標(biāo)活性明顯高于保護(hù)性因子，或者前者為致病始動(dòng)因素，后者為機(jī)體代償性反應(yīng)。根據(jù)多元逐步回歸分析，可以認(rèn)為IL-17是T2DM大血管病變的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能在糖尿病大血管病變發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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