方 芳 許凱揚(yáng) 羅忠銀 陳 穎

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410114)

獼猴桃又名楊桃、藤梨、奇異果等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)療、保健、觀賞等開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，被譽(yù)為“水果之王”、“世界珍果”，是目前世界各國(guó)競(jìng)相發(fā)展的果品之一［1－3］。近年來(lái)，有關(guān)獼猴桃果脯、罐頭、飲料等產(chǎn)品紛紛上市，而加工飲料一項(xiàng)就產(chǎn)生了大量獼猴桃籽。獼猴桃籽油中富含多種不飽和脂肪酸、脂類、黃酮類、酚類、維生素等物質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)亞麻酸含量較高的天然植物油，具有降低血脂、軟化血管和延緩衰老等功效，在醫(yī)學(xué)、保健和美容等領(lǐng)域具有廣泛的用途，具有極高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值［4］。萃取獼猴桃籽油的方法很多，但由于獼猴桃籽油耐熱性能差，采用傳統(tǒng)的熱榨法萃取，油脂中營(yíng)養(yǎng)成分及活性物質(zhì)含量較低，不耐貯藏，產(chǎn)品損失較多，收率低，對(duì)其色澤產(chǎn)生的影響也較大［5－6］。水酶法是一種新興的提油方法，它是以機(jī)械和酶解為手段破壞植物細(xì)胞壁，使油脂得以釋放。該技術(shù)處理?xiàng)l件溫和，工藝路線簡(jiǎn)單(無(wú)需脫溶，可直接利用三相離心分離油、水、渣)，而且可以同時(shí)萃取油和蛋白質(zhì)，生產(chǎn)過(guò)程能耗相對(duì)低，廢水中BOD與COD大為下降，污染少，易于處理［7－10］。試驗(yàn)以獼猴桃籽為原料，采用水酶法萃取獼猴桃籽油，并對(duì)其中的酶解條件進(jìn)行研究，為獼猴桃籽油的萃取探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃籽:湖南湘西“米良一號(hào)”獼猴桃的種子(主要成分是蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)，含油率31.32%，其中亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸占75%以上)，購(gòu)于湖南吉首，40℃烘干后用微型植物粉碎機(jī)粉碎成粉狀(40目);Alcalase:諾維信公司，最適溫度50～60℃，最適pH 8～10;其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平:梅特勒－托利多(中國(guó))公司，HH－8電熱恒溫水浴鍋:上海比朗儀器有限公司，TGL18高速離心機(jī):長(zhǎng)沙英泰離心機(jī)廠，F(xiàn)Z102微型植物粉碎機(jī):上海新諾儀器設(shè)備有限公司，101－3電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將洗凈去雜后的獼猴桃籽于恒溫干燥箱中烘干，再經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粉狀(40目)。每次試驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)確稱取200.0 g于150 mL四頸瓶中，加入一定體積的蒸餾水，混勻、調(diào)整pH，然后加入一定量的酶，置恒溫水浴鍋中并用電動(dòng)攪拌器不斷攪拌，萃取結(jié)束后，在電爐上加熱5 min滅酶，在4 000 r/min離心20 min，收集上層游離油，棄去乳狀液及水解液，將殘?jiān)?00 mL蒸餾水洗滌，混勻，4 000 r/min離心10 min，收集上層游離油，將2次離心所得的游離油合并稱重，然后稱量計(jì)算出油率。出油率=萃取獼猴桃籽油量÷獼猴桃籽脂肪含量×100%。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取獼猴桃籽粉末200.0 g，放入150 mL四頸瓶中，在其他條件相同的情況下，采用不同液料比、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH進(jìn)行試驗(yàn)，逐個(gè)考察各影響因素對(duì)萃取效果的影響。

1.4.2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究選取的工藝條件范圍是:液料比6～14，酶用量1.5% ～3.5%，酶解溫度40～60℃，酶解pH 8.0～10，選用四因素的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，選取因素水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素和編碼水平表

1.4.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS(v3.01專業(yè)版)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1.1 液料比對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

在酶解溫度50℃，pH 9.0，酶解時(shí)間4 h，酶用量為2.5%的條件下，研究不同的液料比對(duì)獼猴桃籽出油率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著液料比的增加，獼猴桃籽的出油率快速上升，在液料比為10時(shí)達(dá)到最高。這可能是由于酶解時(shí)加入的水多有利于蛋白質(zhì)的溶出，對(duì)酶解有利。當(dāng)液料比大于10時(shí)，獼猴桃籽出油率反而有所下降，原因可能是加水量過(guò)多降低了酶與底物的濃度，降低了蛋白酶分子與底物分子的碰撞幾率，從而使酶的作用效果下降，油萃取率降低，因此，選擇液料比為10。

圖1 液料比對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

在液料比10，酶解pH 9.0，酶解時(shí)間4 h，酶用量為2.5%的條件下，研究酶解溫度對(duì)獼猴桃籽出油率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，獼猴桃籽出油率不斷上升，且上升趨勢(shì)明顯，在50℃時(shí)達(dá)到最高，出油率為25.46%，但當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，隨著溫度升高萃取率迅速下降。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，溫度的提高增加了分子的動(dòng)能，促進(jìn)了擴(kuò)散作用的進(jìn)行，酶促反應(yīng)也服從這個(gè)規(guī)律。但不同的是，酶是蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度升高至一定程度時(shí)，酶會(huì)發(fā)生變性，其活性中心的結(jié)構(gòu)被破壞，會(huì)部分甚至完全失去其催化活性，從而降低酶解反應(yīng)速度，根據(jù)試驗(yàn)確定最適宜的酶解溫度為50℃。

圖2 溫度對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

2.1.3 酶添加量對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

在料液比10，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間4 h，pH 9.0的條件下，研究加酶量對(duì)獼猴桃籽出油率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著酶用量的增加，獼猴桃籽出油率不斷升高，這是由于隨著酶濃度的增大，反應(yīng)速率加快，有利于油脂的釋放，但當(dāng)酶用量超過(guò)2.5%時(shí)，出油率增加緩慢，這說(shuō)明當(dāng)酶用量超過(guò)2.5%時(shí)，繼續(xù)增加酶濃度對(duì)獼猴桃籽出油率貢獻(xiàn)不大。因此，選擇酶添加量為2.5%。

圖3 酶用量對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

在料液比10，酶解溫度50℃，pH 9.0，酶用量為2.5%的條件下，研究酶解時(shí)間對(duì)獼猴桃籽出油率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，獼猴桃籽出油率不斷上升，但當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)4 h，出油率增幅很小。這說(shuō)明酶解反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后，由于底物減少及抑制作用增強(qiáng)等原因，油脂的釋放就不再進(jìn)一步增加，出油率趨于恒定。因此，選擇酶解時(shí)間為4.0 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

2.1.5 酶解pH對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

在料液比10，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間4 h，酶用量2.5%的條件下，研究酶解pH對(duì)獼猴桃籽出油率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，獼猴桃籽出油率隨著酶解pH的升高而迅速增加，在pH 9.0時(shí)達(dá)到最高，出油率為25.46%。但當(dāng)pH超過(guò)9.0時(shí)，萃取率隨pH的升高而下降，這可能與堿性蛋白酶的最適酶解pH有關(guān)，當(dāng)酶解pH偏離其最適pH時(shí)不利于堿性蛋白酶作用，酶活下降嚴(yán)重，細(xì)胞壁的破壞效果減弱不利于獼猴桃籽油的萃取。

圖5 酶解pH對(duì)獼猴桃籽出油率的影響

2.2 水酶法提取工藝優(yōu)化模型的建立

2.2.1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

由DPS(v3.01專業(yè)版)統(tǒng)計(jì)分析軟件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)功能可知，四因子二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)包括36個(gè)試驗(yàn)方案，具體試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表2結(jié)果，建立獼猴桃籽出油率與液料比X1、酶添加量X2、酶解溫度 X3、酶解 pH X4四因子的數(shù)學(xué)回歸模型為:Y=26.184 17－0.223 33X1－

試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。由方差分析可知:回歸方程的失擬性檢驗(yàn) F1=2.089 ＜(10，11)=2.94，差異不顯著，說(shuō)明所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?回歸方程的顯著性檢驗(yàn) F2=15.451＞(14，21)=3.49，極顯著，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常吻合，模型成立。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，在a=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的方程為:

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.2.2 各因素的影響強(qiáng)弱分析

各因素的F值可以反映出各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大。從方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)獼猴桃籽出油率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)?液料比＞酶解pH＞酶添加量＞酶解溫度。

2.2.3 雙因素交互作用分析

由方差分析可知，X1、X2、X43個(gè)因素之間存在交互作用，分析結(jié)果見(jiàn)圖6～圖8。由圖6～圖8可知，隨著液料比(X1)和酶添加量(X2)的增加，出油率呈上升趨勢(shì)，達(dá)到一定程度時(shí)，出油率達(dá)到最大;但當(dāng)液料比和酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，出油率開(kāi)始下降。液料比(X1)與酶解pH(X4)具有正相關(guān)的協(xié)同作用，交互作用可獲得更高的出油率，但當(dāng)二者增大到一定值時(shí)，出油率增加不明顯。酶添加量(X2)與酶解pH(X4)的交互作用表明，二者水平介于－2和0水平之間時(shí)，出油率隨水平的增加而明顯增加;當(dāng)二者水平在0水平以上時(shí)，出油率隨水平的增加而下降，這可能與堿性蛋白酶的最適酶解pH有關(guān)，當(dāng)酶解pH偏離其最適pH時(shí)不利于堿性蛋白酶作用，酶活下降嚴(yán)重，細(xì)胞壁的破壞效果減弱不利于獼猴桃籽油的萃取。

2.2.4 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化及驗(yàn)證

采用頻率分析法尋找最優(yōu)萃取條件，其中出油率高于24.13%的方案有79個(gè)，頻率分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)出油率高于24.13%的平均值優(yōu)化萃取方案為:液料比10，酶添加量2.5%，酶解溫度50℃，酶解pH 9.0。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得獼猴桃籽出油率為25.46%，與理論值(26.18%)接近，其相對(duì)誤差為2.75%，驗(yàn)證了回歸模型的適合性。

本試驗(yàn)用獼猴桃籽含油量為31.32%，在優(yōu)化條件下，一次提取獼猴桃籽的出油率為25.46%，萃取率為81.30%;浸提2次獼猴桃籽出油率為27.17%，萃取率達(dá)86.75%。

表4 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)和二次多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)分析，得到水酶法提取獼猴桃籽油的4個(gè)主要影響因素液料比、加酶量、酶解溫度、酶解pH與出油率之間的優(yōu)化數(shù)學(xué)模型為:Y=26.184 17－，此模型在本試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)獼猴桃籽的出油率。

3.2 通過(guò)方差分析可知，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)獼猴桃籽出油率影響強(qiáng)弱順序依次為:液料比＞酶解pH＞酶添加量＞酶解溫度。

3.3 采用頻率分析法得到水酶法提取獼猴桃籽油的最優(yōu)工藝條件為:液料比為10，酶添加量2.5%，酶解溫度50℃，酶解pH 9.0，酶解時(shí)間4h，提取2次。在此條件下，獼猴桃籽的出油率為27.17%，萃取率達(dá) 86.75%。

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