王衛(wèi)國 朱占齊 吳興泉

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院河南工業(yè)大學(xué)飼料工程技術(shù)研究所，鄭州 450001)

轉(zhuǎn)基因大豆是較早商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物之一。第一個(gè)大面積生產(chǎn)應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因大豆是抗草甘膦大豆，是在傳統(tǒng)大豆中轉(zhuǎn)入外源基因CaMV－35S啟動(dòng)子、抗草甘膦基因CP4－EPSPS和NOS終止子而得到的。目前，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積已占全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植總面積的60%以上，占全部大豆種植面積的70%，獲得了很大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［1－2］。

目前在國際上對轉(zhuǎn)基因食品安全性的評價(jià)原則是實(shí)質(zhì)等同性原則［3－4］。據(jù)此，Monsanto公司對培育的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆品種進(jìn)行了食品安全評價(jià)，結(jié)果未表明CP4－EPSPS有毒。但人們對轉(zhuǎn)基因大豆的食用和飼用的安全性仍存疑慮，需要作進(jìn)一步研究。而利用加工手段使外源基因降解失效可能是提高轉(zhuǎn)基因食品或飼料的安全性的途徑之一。

在食品或飼料加工過程對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因影響的研究相對較少［5］。而擠壓膨化加工對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的影響也鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)的目的是了解在不同溫度、轉(zhuǎn)速和水分參數(shù)的工藝條件下擠壓膨化對Roundup Ready大豆外源基因CP4－EPSPS的降解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

轉(zhuǎn)基因大豆:鄭州陽光油脂有限公司提供。

1.1.2 CP4－EPSPS基因擴(kuò)增引物

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6－8］，在轉(zhuǎn)基因大豆 Roundup Ready中，CP4－EPSPS蛋白基因共有1 946個(gè)堿基。根據(jù) Genbank中 CP4－EPSPS基因的基因序列(AY125353)，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增不同長度CP4－EPSPS基因片段的引物(引物序列見表1)，所有引物均由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因特異性引物序列

1.1.3 試劑

DP－320試劑盒:天根生化科技有限公司;Taq酶、dNTPs、PCR緩沖液、分子質(zhì)量 Marker(100～2 000 bp)、無水乙醇、三氯甲烷、巰基乙醇、瓊脂糖:鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

9FQ20錘片粉碎機(jī):江西紅星機(jī)械廠;DS－2型雙螺桿擠壓膨化機(jī):濟(jì)南賽信膨化機(jī)械有限公司;AUCMA冷藏冷凍箱:青島澳柯瑪股份有限公司;梯度PCR儀:德國Bio－metra公司;JJ－CJ－1CU潔凈工作臺(tái):吳江市凈化設(shè)備總廠;DYY－6C型電泳儀:北京市六一儀器廠;紫外凝膠成像系統(tǒng):美國Biorad公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品水分的測定

按GB 5479—1985糧食、油料檢驗(yàn)水分測定法測定樣品的水分。

1.2.2 樣品的加工制備

挑選籽粒飽滿的大豆，粉碎并過60目篩，按表2工藝條件進(jìn)行擠壓膨化，并收集樣品進(jìn)行CP4－EPSPS基因不同長度片段的擴(kuò)增。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆擠壓膨化加工的參數(shù)設(shè)置

表2中選取擠壓腔溫度為100、115、130℃的依據(jù)是，擠壓膨化腔溫度超過130℃到150℃時(shí)，會(huì)使大豆蛋白嚴(yán)重變性，降低飼用價(jià)值;選擇物料水分為14%、17%、20%的考慮是這一范圍對應(yīng)于大豆擠壓膨化的干法和濕法加工范圍，可以與實(shí)際生產(chǎn)對應(yīng);螺桿轉(zhuǎn)速選擇范圍對應(yīng)于物料所受擠壓剪切作用的強(qiáng)弱，而喂料轉(zhuǎn)速梯度變化則可反映物料流量變化對擠壓膨化效果的影響。

1.2.3 DNA 的提取

收集經(jīng)各工藝條件加工的樣品以提取DNA。稱取固體樣品60 mg，所有樣品均采用天根DP305試劑盒進(jìn)行DNA提取，方法按照天根生化科技有限公司提供的說明書進(jìn)行。

1.2.4 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆DNA質(zhì)量濃度檢測

采用紫外可見光光度計(jì)法測定抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組的質(zhì)量濃度，按公式(1)計(jì)算:

式中:Cm為總DNA質(zhì)量濃度/ng/μL;為紫外可見光光度計(jì)讀數(shù);λ為50 ng/μL;Vw為雙蒸水體積2 900μL;Vs為樣品體積100μL。

1.2.5 PCR 擴(kuò)增

本研究檢測了抗草甘膦CP4－EPSPS目的基因4條長度不等的片段，使用未加工轉(zhuǎn)基因大豆外源基因作為模板DNA作為陽性對照，確保試驗(yàn)操作和體系正常，雙蒸水空白對照無檢測產(chǎn)物出現(xiàn)，說明PCR操作過程無污染。

本試驗(yàn)建立和優(yōu)化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆粉PCR檢測方法均采用相同的PCR反應(yīng)體系，總反應(yīng)體積 50 μL，10 × Buffer 5 μL，dNTPs(10 μmol/L)2μL，引物(10 μmol/L)2 μL，Taq酶 1 U，模板 DNA 1μL(約100 ng)，加ddH2O補(bǔ)足至50μL。

反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，4條不同長度片段PCR檢測反應(yīng)條件如表3所示。

表3 PCR檢測反應(yīng)條件

1.2.6 最低檢測限分析及序列測定

將質(zhì)量濃度約為50 ng/μL的轉(zhuǎn)基因大豆DNA和雙蒸水分別按體積比為50%、25%、12.5%、5%和1%的比例充分混合，雙蒸水為空白對照，按1.2.5優(yōu)化的PCR檢測方法進(jìn)行檢測，確定加工處理樣品總DNA的最低檢測限。

將陽性檢測產(chǎn)物進(jìn)行測序，4條片段分別隨機(jī)測定一個(gè)反應(yīng)，以避免出現(xiàn)假陽性。

1.2.7 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上90 V電泳45 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆的含水量

按GB 5479—1985糧食、油料檢驗(yàn)水分測定法測得的轉(zhuǎn)基因大豆的含水量為9.06%。

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆在擠壓膨化過程中色澤變化

擠壓膨化時(shí)，物料在高壓、高溫工況下呈現(xiàn)熔融狀態(tài)，一旦由?？讛D出，壓力驟然降為常壓，水分便發(fā)生急驟的蒸發(fā)、汽化，產(chǎn)品隨之膨脹，水分從物料中逸出中并帶走大量熱量，使物料在瞬間從擠壓膨化時(shí)的高溫迅速降至80℃左右，從而使物料固化定型，并保持膨化后的形狀［8］。

擠壓膨化產(chǎn)品的色澤是反映擠壓膨化熱處理程度的重要標(biāo)志之一。當(dāng)擠壓腔溫度為100℃時(shí)，各處理組擠壓膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆樣品均呈現(xiàn)金黃色，顆粒松散，不同處理間產(chǎn)品色澤差異不明顯(圖1);當(dāng)擠壓腔溫度為115℃時(shí)，各處理組的轉(zhuǎn)基因大豆樣品均呈現(xiàn)黃褐色，同溫度下的3個(gè)不同處理之間樣品色澤差異不明顯(圖2);當(dāng)擠壓腔溫度為130℃時(shí)，各處理組的轉(zhuǎn)基因大豆樣品均呈現(xiàn)深褐色，甚至有碳化黑色顆粒出現(xiàn)(圖3)。由圖1～圖3可見，隨著擠壓腔溫度的上升，轉(zhuǎn)基因大豆樣品中蛋白質(zhì)的變性程度在加重。在處理溫度130℃下，樣品J8、J9中出現(xiàn)了少量碳化顆粒，表明部分蛋白質(zhì)已經(jīng)損壞，轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因也會(huì)造成部分損壞或降解。

2.3 擠壓膨化處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆DNA質(zhì)量濃度

按試驗(yàn)的方法提取轉(zhuǎn)基因大豆基因組并測得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組質(zhì)量濃度見表4。

試驗(yàn)測得未加工大豆外源基因組的質(zhì)量濃度為85 ng/μL。由表4中的極差分析可知，擠壓腔溫度是影響大豆基因組質(zhì)量濃度的最主要因素，溫度越高，基因組質(zhì)量濃度越低，由100℃上升到130℃，大豆基因組質(zhì)量濃度平均下降39.7 ng/μL。含水量的影響趨勢與溫度相同，含水量越高，大豆基因組質(zhì)量濃度越低，但該因素的影響程度遠(yuǎn)低于溫度，水分由14%升至20%，大豆基因組質(zhì)量濃度平均下降10.8 ng/μL。螺桿轉(zhuǎn)速和喂料器轉(zhuǎn)速對大豆基因組質(zhì)量濃度的影響最小，且影響隨參數(shù)值的增大先增加后降低。表明，螺桿轉(zhuǎn)速和喂料器轉(zhuǎn)速既不應(yīng)過慢也不能過快，有一適宜值。經(jīng)130℃擠壓膨化處理后的質(zhì)量濃度最低值降至35 ng/μL左右。

表4 不同擠壓膨化處理抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組質(zhì)量濃度

2.4 轉(zhuǎn)基因大豆在擠壓膨化過程中外源基因CP4－EPSPS的降解情況

擠壓膨化過程中大豆外源基因CP4－EPSPS受不同加工參數(shù)作用而降解的情況見圖4。在擠壓腔溫度為100℃的條件下，擠壓膨化大豆樣品中大小為1 512、807、408和206 bp的外源基因片段都能檢測到(圖4各圖中的1、2、3泳道圖);在溫度為115℃的擠壓條件下，樣品J4、J6中只能檢測到807、408和206 bp的CP4－EPSPS基因的片段。而樣品J5僅能檢測到408 bp和206 bp的CP4－EPSPS基因的片段(圖4);當(dāng)擠壓溫度達(dá)到130℃時(shí)，外源基因片段驟然降至206 bp以下(圖4)，本試驗(yàn)中已經(jīng)無法檢測其外源基因的片段大小，表明外源基因已降解較充分。本次試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，擠壓腔內(nèi)溫度是影響外源基因降解的主要因素，其次為水分，二者的復(fù)合作用是正向加強(qiáng)的。

圖4 擠壓膨化抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4－EPSPS的PCR檢測

3 討論

3.1 擠壓腔溫度對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因 CP4－EPSPS的影響

溫度是影響植物內(nèi)外源基因穩(wěn)定性的最重要因素之一。對非轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)不同加工處理后的DNA狀態(tài)的研究表明，干熱條件下，93℃加熱處理4 min，小麥的DNA保持完整。93℃加熱處理5 min以上時(shí)，小麥DNA發(fā)生部分降解。而95℃熱處理5 min，小麥DNA降解。當(dāng)采用100℃至125℃的高壓蒸汽處理1 min以上時(shí)，小麥的DNA降解。其他研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過100℃溫度處理的含GM菜粕和非GM菜粕的兩種飼糧中的DNA的濃度較未經(jīng)熱處理的飼糧的DNA濃度有顯著降低，但仍能檢出大分子質(zhì)量的DNA［5］。陳穎等［8］等研究表明，豆腐、豆奶、豆粉加工過程中經(jīng)過磨漿、點(diǎn)漿、高溫殺菌(110℃以上)、噴霧干燥等處理后，產(chǎn)品中只能檢測出190 bp左右的外源基因片段。

Gawienowski等［9］研究表明，當(dāng)玉米在135 ℃加熱2 h后，在玉米蛋白中已無法檢測到DNA，這說明當(dāng)溫度超過了135℃時(shí)，基因組破壞比較嚴(yán)重，甚至被完全降解。擠壓膨化的特點(diǎn)是機(jī)械作用力強(qiáng)，溫度高，物料在機(jī)內(nèi)滯留時(shí)間短(少于30 s)，本試驗(yàn)將擠壓腔溫度梯度選擇在100～130℃是合理的。溫度條件既要保證外源基因有效降解，又要最大限度保留大豆中必需氨基酸的生物學(xué)效價(jià)。研究結(jié)果表明，115℃和130℃的處理?xiàng)l件可以分別將EPSPS基因的片段降至807 bp和206 bp以下。但對必需氨基酸的生物學(xué)效價(jià)本次試驗(yàn)未作測定。

3.2 含水量對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4－EPSPS降解的影響

水分是各種生化反應(yīng)的媒介。低水分條件下，擠壓膨化腔內(nèi)大豆蛋白分子難以充分伸展，各類化學(xué)反應(yīng)難以均勻進(jìn)行，因而會(huì)影響蛋白質(zhì)變性降解反應(yīng)速率。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，同一擠壓腔溫度下，隨著被擠壓物料含水量增加，產(chǎn)品中大豆基因組質(zhì)量濃度提取率降低，即大豆內(nèi)外源基因組降解率提高。含水量與擠壓腔溫度有正向協(xié)同增效作用。在實(shí)際轉(zhuǎn)基因大豆的擠壓膨化加工中，應(yīng)采用20%的含水量，這樣既能提高外源基因降解效率，又可以提高設(shè)備生產(chǎn)率。

3.3 螺桿轉(zhuǎn)速和喂料器轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4－EPSPS降解的影響

螺桿轉(zhuǎn)速影響物料在擠壓膨化機(jī)內(nèi)的滯留時(shí)間，螺桿轉(zhuǎn)速越慢，物料在機(jī)內(nèi)滯留時(shí)間越長，受熱處理時(shí)間越長。但物料所受的機(jī)械剪切、擠壓力則相對減弱。要獲得好的處理效果，需要尋求熱處理時(shí)間與機(jī)械剪切、擠壓力之間的平衡。這就需要尋找一個(gè)最佳螺桿轉(zhuǎn)速值。由表2的極差分析可以看出，中等螺桿轉(zhuǎn)速(72 r/min)為適宜值。

喂料器轉(zhuǎn)速主要影響擠壓膨化機(jī)的流量，轉(zhuǎn)速越高，喂料流量越大。當(dāng)機(jī)內(nèi)充滿物料的情況下，增大流量會(huì)提高物料通過擠壓膨化機(jī)的速度，減少滯留時(shí)間，但同時(shí)增大機(jī)械擠壓剪切作用。因此，喂料器轉(zhuǎn)速既不能過高也不能過低，需要一個(gè)最佳值。由表2的極差分析可以看出，中等喂料器轉(zhuǎn)速(88 r/min)為適宜值。

3.4 轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4－EPSPS降解片段的安全性

目前，有關(guān)降解后的轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4－EPSPS片段大小的安全性尚無明確結(jié)論。一般認(rèn)為，外源基因降解到100 bp以下，其作為特定基因已經(jīng)被徹底降解，其原有的基因功能已經(jīng)喪失。被降解的外源基因片段被動(dòng)物食用后在體組織內(nèi)重新組裝或插入到動(dòng)物自身內(nèi)源基因中發(fā)揮外源基因功效或引起內(nèi)源基因突變的情況未見報(bào)道。這些片段在動(dòng)物組織內(nèi)應(yīng)是主要作為氨基酸供體或小肽供體為動(dòng)物所利用。但要對它們的安全性作出最終明確結(jié)論尚需進(jìn)一步的、長期的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，擠壓膨化加工是降解轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CP4－EPSPS的有效手段。擠壓膨化參數(shù)中，對外源基因降解作用由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?擠壓腔溫度＞物料水分＞螺桿轉(zhuǎn)速或喂料器轉(zhuǎn)速。本試驗(yàn)條件下的最佳擠壓膨化參數(shù)組合為:擠壓腔溫度130℃，物料水分20%，螺桿轉(zhuǎn)速72 r/min，喂料器轉(zhuǎn)速88 r/min。在此條件下，大豆外源基因片段可降至206 bp以下而未能檢出。

［1］李靜，李紅芳，張換樣，等.全球轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(1):3 －8

［2］葉增民，潘婕.轉(zhuǎn)基因大豆及其制品的安全性研究現(xiàn)狀［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009(2):26 －28

［3］葉漢英，楊偉華.轉(zhuǎn)基因大豆中的發(fā)展及其安全性評價(jià)［J］.糧油加工，2007(4):45 －48

［4］張軍民，胡廣東，高振川.轉(zhuǎn)基因食品與飼料安全及其評價(jià)［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2002，4(4):21 －25

［5］王衛(wèi)國，過世東.GM飼料DNA在加工和畜禽消化道中的降解——轉(zhuǎn)基因飼料安全性評價(jià)［J］.糧食與飼料工業(yè)，2004(10):38－40

［6］Meyer R.Development and application of DNA analytical methods for the detection of GMOs in food［J］.Food Control，1999，10:391 －399

［7］Ahmed F E.Detection of genetically modified organisms in food［J］.Trends in Biotechnology，2002，20(5):215 －223

［8］陳穎，王媛，徐寶梁，等.Roundup Ready大豆外源基因在食品加工過程中的降解變［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2005，27(2):10－14

［9］Gawienowski M C，Eckhoff SR，Yang P，et al.Fate of maize DNA during steeping and processing［J］.Cereal Chemistry，1999，76(3):371 －374.