肖順林，羅宏麗，馮碧敏

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000)

雙花解毒合劑是由金銀花、黃芩、板藍(lán)根、連翹、麥冬5味中藥制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、利咽止咳等功效，適用于外感風(fēng)熱所致咽喉腫痛、口干咳嗽、急性上呼吸道感染、急性咽炎、扁桃體炎、支氣管炎等病癥[1－3]，已在臨床應(yīng)用多年且療效確切。金銀花為本方的主藥之一，主要成分為綠原酸，具有治療呼吸道感染、消炎解毒、涼血散熱的功效?，F(xiàn)將綠原酸作為控制雙花解毒合劑質(zhì)量的指標(biāo)，采用高效液相色譜法對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定，其結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司);Kromasystem 2000色譜工作站(Bio.Tek Instrument Snl公司);Hamiltn ASO－0023型液相色譜進(jìn)樣器;Sartorius 1712型分析天平(德國(guó)Sartorius公司);AS10200型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100203);雙花解毒合劑(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，川藥制字 Z20070512，批號(hào)分別為 100203，100302，100303，100401，100402，規(guī)格為每支20mL);磷酸二氫鈉為分析純，乙腈為色譜純(美國(guó)Tedia公司)，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:HypersilC18柱(250mm×4.6mm，5μm);柱溫:40℃;流動(dòng)相:0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2)－甲醇(87 ∶13);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):327 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品18.2mg，置50mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含364μg的綠原酸溶液，作為對(duì)照品貯備液(于10℃以下保存)。精密量取雙花解毒合劑1mL，置具塞離心管中，加50%甲醇3mL，搖勻，于冰箱中放置過(guò)夜。藥液過(guò)夜后，置離心機(jī)，以3 000 r/min的速度離心15min，上清液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中。沉淀用2mL 50%甲醇洗滌，洗滌液置離心機(jī)，以3 000 r/min的速度離心5min;將兩次離心得到的上清液收集至同一容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻即得供試品溶液。按處方比例稱取不含金銀花的其他藥材，按雙花解毒合劑生產(chǎn)工藝制備不含綠原酸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法處理，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):分別精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，在此色譜條件下，對(duì)照品溶液與供試品溶液主成分峰的保留時(shí)間基本一致，陰性對(duì)照無(wú)干擾;理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)大于4 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密量取綠原酸對(duì)照品溶液(364μg/mL)0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，以 50% 甲醇溶液定容至 2mL，搖勻。分別精密吸取20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以綠原酸峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=1.165 2X －5.638(r=0.999 1，n=5)。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在36.4～182.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液(109.2μg/mL)20μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD=1.06%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液適量，在室溫條件下分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣 20 μL，記錄峰面積。結(jié)果的RSD=1.16%(n=8)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn):精密量取已知含量的雙花解毒合劑1mL，置離心管中，再分別精密加入低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的綠原酸對(duì)照品溶液，依法制備溶液，置10mL容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為110203)樣品6份，依法制備供試品溶液，照擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸的平均含量為 785.239 μg/mL，RSD=1.12%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

表1 綠原酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中綠原酸的含量。結(jié)果批號(hào)為110203，220417，110525 的樣品中，綠原酸含量分別為 776.678，795.832，801.365 μg/mL，其 RSD 分別為 0.52%，0.71% ，0.67%(n=3)。

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇:檢測(cè)波長(zhǎng)一般在324～330 nm之間，本試驗(yàn)以50%甲醇為溶劑，將對(duì)照品溶液及供試品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外掃描，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

流動(dòng)相選擇:文獻(xiàn)[4－7]采用了0.4%磷酸－乙腈(90∶10)、0.4%磷酸 －乙腈(87∶13)、0.4%磷酸 －乙腈(85 ∶15)作為流動(dòng)相，本試驗(yàn)曾用0.4%磷酸－乙腈(90∶10)、0.4%磷酸－乙腈(87∶13)作為流動(dòng)相，結(jié)果色譜峰的峰型及峰的對(duì)稱性較差，拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，重復(fù)性也較差，均不能得到滿意的色譜峰，后來(lái)選擇甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2)作為流動(dòng)相，并對(duì)流動(dòng)相的比例、柱溫和流速進(jìn)行反復(fù)篩選，最后確定了色譜工作條件。在該條件下進(jìn)行測(cè)定，得到了良好的峰形、適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間和較高的理論板數(shù)(均符合藥典相關(guān)規(guī)定)。

提取溶劑選擇:在相同條件下，考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇及流動(dòng)相作為提取溶劑。結(jié)果表明，50%甲醇的提取率最高，且甲醇、乙醇、50%乙醇及流動(dòng)相的樣品溶液在放置較短時(shí)間(約2 h)后，顏色均有變化，且峰面積有所下降，影響了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而用50%甲醇作為溶劑在10 h內(nèi)均無(wú)變化，因此本試驗(yàn)選擇50%甲醇作為提取溶劑。

提取時(shí)間選擇:在相同條件下，考察了樣品在15，20，25，30，35min超聲后的提取率。結(jié)果表明，樣品在超聲30min時(shí)提取率最高，在25min和35min時(shí)均未明顯提高，因此本試驗(yàn)選擇超聲30min作為樣品的提取時(shí)間。

[1]WS3－366(Z－52)－97(Z)，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄114－附錄116.

[3]邱華榮，田 吉，馮文宇，等.青銀注射液中綠原酸和樟腦的含量測(cè)定[J].中成藥，2004，26(8):621－623.

[4]余 杰，匡遼紅，林凡勝，等.HPLC測(cè)定復(fù)方雙花口服液中綠原酸的含量[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2010，7(3):32 －34.

[5]梅 林，賴 容.HPLC法測(cè)定復(fù)方金銀花中綠原酸的含量[J].激光雜志，2010，31(2):6.

[6]唐 奇.HPLC法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(19):133 －134.

[7]黃群蓮，唐 燦，李婷婷.優(yōu)選雙花解毒合劑金銀花超聲提取工藝[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34(5):34－36.