高云航，王 巍，李秋菊，馬紅霞，婁玉杰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118)

木質(zhì)素和纖維素是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，二者與半纖維素構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于降解的整體，在秸稈等農(nóng)作物中，木質(zhì)素會(huì)締結(jié)成木質(zhì)素鞘，與纖維素和半纖維素環(huán)繞在一起，使得秸稈等作物難于降解，甚至變?yōu)閺U物。目前全球每年可產(chǎn)生木質(zhì)素及纖維素的數(shù)量龐大，主要以農(nóng)作物廢棄秸稈形式存在［1］，因此如何加速分解利用此類對解決環(huán)境問題和維持生態(tài)平衡等方面意義重大。

隨著科技不斷發(fā)展，微生物的多樣性研究日益受到科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注［2］。白蟻是自然界木質(zhì)素和纖維素類物質(zhì)的重要分解者，特別是白蟻后腸的微生物在木質(zhì)素及纖維素生物循環(huán)中發(fā)揮舉足輕重的作用［3］。本研究從白蟻腸道分離篩選出具有木質(zhì)素和纖維素雙重降解功能菌株，選取功能最強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA序列分析并對最適產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為木質(zhì)素及纖維素廢物資源化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試白蟻 黑胸散白蟻 (購自浙江大學(xué))。

1.1.2 培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉 (CMC-Na)培養(yǎng)基:CMC-Na 20 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃滅菌30 min。

苯胺藍(lán) (Azure-B)培養(yǎng)基:木質(zhì)素 10 g，(NH4)2SO44.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO44.3 g，CaCl20.3 g，苯胺藍(lán)0.1 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基:CMC-Na 5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨1 g，秸稈粉5 g，NaCl 5 g，pH7.0，121℃滅菌15～30 min。

產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉(w/%)0.5，蛋白胨 (w/%)1，牛肉膏 (w/%)0.5，NaCl(w/%)0.5，調(diào) pH 7.0，121℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 引物 采用細(xì)菌16S rRNA通用引物。上游:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.1.4 主要試劑及主要儀器 Azure-B、剛果紅、DNS(酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、NaOH、苯酚)(北京鼎國生物技術(shù)公司)，藜蘆醇 (Sigma公司)，膠回收試劑盒 (杭州維特潔生化技術(shù)有限公司)。恒溫培養(yǎng)箱DHP－9082;氣浴恒溫振蕩器SH2－82;低溫冷凍離心機(jī);凝膠成像系統(tǒng);三恒電泳儀、DYYIll33B水平平板電泳槽;紫外可見分光光度計(jì)Gene Amp PCR System9700。

1.2 方法

1.2.1 木質(zhì)素、纖維素分解菌的初篩 將數(shù)只成年黑胸散白蟻 (液氮保存)經(jīng)消毒、去除頭胸部后，制成白蟻腹部勻漿，并將其梯度稀釋至10－6級。分別取 10－4、10－5、10－6級的樣品 100 μL 涂布于CMC-Na平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 h;用三區(qū)劃線法得到單菌落后將其點(diǎn)種于CMC-Na培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)48 h;待長出菌落，用1 mg/mL剛果紅浸染15 min，傾去染液，并以1 mol/L NaCl水溶液脫色，觀察水解圈大小。

同時(shí)分別取不同稀釋度的樣品100 μL接種于以木質(zhì)素為碳源的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5 d。將平板置于白色背景下，觀察有無透明圈。挑取單菌落至含苯胺藍(lán) (Azure-B)的培養(yǎng)基中，37℃避光培養(yǎng)7 d，每天觀察記錄，以Azure-B培養(yǎng)基中菌落的脫色圈的有無及脫色圈的大小定性篩選出產(chǎn)酶快、產(chǎn)酶活高的菌株。

1.2.2 木質(zhì)素、纖維素分解菌的復(fù)篩 將活化的菌株接種到液態(tài)種子培養(yǎng)基中，置37℃搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)24 h;按1%接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h;取上述發(fā)酵液于4 500 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。纖維素降解酶活力測定采用DNS法［4］，木質(zhì)素過氧化物酶活力測定采用藜蘆醇法［5］。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定 經(jīng)初篩、復(fù)篩得到酶活力較高的菌株，觀察其菌落形態(tài)，并經(jīng)革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài)和染色特征。細(xì)菌生化鑒定參考文獻(xiàn) ［6］進(jìn)行。

1.2.4 菌株16S rRNA鑒定 細(xì)菌基因組DNA的提取按照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。PCR反應(yīng)采用25 μL體系:DNA模板 0.5 μL;上下游引物各 0.5 μL;dNTP 2 μL;10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL;Ex Taq 酶0.3 μL;無菌去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增條件依次為94℃5 min;94℃1 min;50℃1 min;72℃1 min;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存，w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物與pMD18－T載體連接后送生物公司測序。用BLAST軟件對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，獲取相近典型菌株基因序列，利用DNAStar中MegAlign軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1)碳源對產(chǎn)酶活力的影響。

改變產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，分別以羧甲基纖維素鈉，葡萄糖，秸稈，木質(zhì)素、秸稈混合物，乳糖，羧甲基纖維素鈉、秸稈混合物，木質(zhì)素為碳源，編號設(shè)為1～7。按1%接種量接種，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力，根據(jù)測定結(jié)果分析不同碳源對酶活力的影響。

2)氮源對產(chǎn)酶活力的影。

在確定了碳源的基礎(chǔ)上，分別以牛肉膏，蛋白胨，酵母粉，酒石酸銨，硫酸銨，酵母粉、硫酸銨混合物，牛肉膏、蛋白胨混合物為氮源，編號設(shè)為1～7，按1%接種量接種，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力，根據(jù)測定結(jié)果分析不同碳源對酶活力的影響。

3)初始pH對產(chǎn)酶活力的影響。

在確定碳源、氮源基礎(chǔ)上，將產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的初始pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，將種子液按1%接種量接種，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力。

4)發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶活力的影響。

在確定最佳碳源、氮源和最適初始pH基礎(chǔ)上，發(fā)酵溫度分別設(shè)置為27、32、37、42、47和52℃。將種子液按1%接種量接種，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力。

5)發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶活力的影響。

在確定最佳碳源、氮源以及最適初始pH和發(fā)酵溫度基礎(chǔ)上，將種子液按1%接種量接種，37℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后間隔12 h取樣1次，進(jìn)行酶活力測定。

6)接種量對酶活的影響。

在確定了最佳碳源、氮源、初始pH以及最適發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間基礎(chǔ)上，將種子液按1%，3%，5%，7%，11%不同濃度接種，觀察不同接種量對酶活力的影響。

2 結(jié)果

2.1 木質(zhì)素、纖維素分解菌初篩結(jié)果

利用剛果紅培養(yǎng)基和Azure-B培養(yǎng)基，從白蟻腸道內(nèi)篩選出5株在兩種培養(yǎng)基上均有明顯反應(yīng)圈(圖1)的細(xì)菌，可初步說明分離菌株對纖維素和木質(zhì)素均有一定的分解作用。

圖1 菌株在篩選培養(yǎng)基上的脫色圈及水解圈Fig.1 The clear hydrolytie zone on the screening plate

2.2 木質(zhì)素、纖維素分解菌復(fù)篩結(jié)果

將5株同時(shí)具有木質(zhì)素及纖維素分解功能的菌株分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測定酶活力，其中菌株MX5產(chǎn)纖維素酶活力最高，其酶活為12.404 U/mL。且其木質(zhì)素過氧化物酶活力達(dá)102 U/L。

2.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察和生化鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 菌株MX5為需氧菌，肉眼可見該菌在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整齊且不光滑，表面有皺褶，菌落不透明。經(jīng)革蘭氏染色于顯微鏡下觀察呈單生，革蘭氏陽性芽孢桿菌 (圖2)。

圖2 菌株MX5的革蘭氏染色 (1 000×)Fig.2 The Gram staining of stain MX5(1 000×)

2.3.2 生化鑒定 參照菌株MX5生化試驗(yàn)結(jié)果(表1)和伯杰氏細(xì)菌分類手冊，此分離菌株符合芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的生化試驗(yàn)特性。

表1 菌株MX5生化試驗(yàn)結(jié)果1)Table 1 The results of biochemistry test for MX5

2.4 菌株16S rRNA鑒定

2.4.1 菌株16S rRNA序列擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增出1 451 bp的16S rRNA，其大小與預(yù)期結(jié)果相符 (圖3)。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis result of PCR product

圖4 菌株MX5系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of stain MX5

2.4.2 序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將菌株MX5陽性質(zhì)粒送生物公司測序，結(jié)果為1 451 bp(登錄號JX027378)。用NCBI中BLAST軟件對菌株MX5 16S rRNA測序結(jié)果進(jìn)行分析:MX5與Bacillus licheniformisstrain GD3a的相似性最高，達(dá)99%。用DNAStar中MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖4)，可知MX5與Bacillus licheniformisstrain DQgbc4的親緣關(guān)系最近，同源性為97.1%，最終確定菌株MX5為芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis。

2.5 菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 碳源和氮源對菌株酶活的影響 由圖5(a)可知，菌株MX5以葡萄糖、乳糖為碳源時(shí)產(chǎn)生的酶活力最高。但是在實(shí)際應(yīng)用中，由于葡萄糖、乳糖均屬于分析純制劑，價(jià)格較昂貴，因此采用價(jià)格廉價(jià)，產(chǎn)酶能力比葡萄糖、乳糖稍低的秸稈作為最佳碳源進(jìn)行深入研究。

由圖5(b)可知，產(chǎn)酶活力最高的是以酵母粉和硫酸銨混合物為氮源，產(chǎn)酶活力最低的是硫酸銨和酒石酸銨，所以本試驗(yàn)選用酵母粉和硫酸銨混合物為氮源進(jìn)行下一步研究。

2.5.2 初始pH和發(fā)酵溫度對菌株酶活的影響由圖6(c)可知，當(dāng)pH3.0時(shí)菌株MX5產(chǎn)酶活力較低，纖維素酶活力為0.13 U/mL，木質(zhì)素酶活力為0。隨著pH值升高酶活逐漸升高，在pH8.0時(shí)，酶活性達(dá)到最高，纖維素酶活力為4.54 U/mL，木質(zhì)素酶活力為102 U/L。在pH10時(shí)，纖維素酶活力略有上升，木質(zhì)素酶活力呈下降趨勢。由圖6(d)可知，菌株MX5的酶活在37℃達(dá)到頂峰。隨著溫度繼續(xù)升高，菌株MX5酶活較大幅度的降低，因此選擇37℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.5.3 發(fā)酵時(shí)間和接種量對菌株酶活的影響 由圖7(e)可知，將種子液接種24 h后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酶活逐漸升高，并于96 h達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢。由圖7(f)可知，接種量為1%時(shí)，產(chǎn)酶活性最高，纖維素酶活力為9.35 U/mL，木質(zhì)素酶活力為76.5 U/L。

3 討論

產(chǎn)酶條件優(yōu)化方面，由于菌株不同，最適產(chǎn)酶條件一般會(huì)存在差異。本試驗(yàn)菌株在pH8.0時(shí)酶活力最強(qiáng)。不同的菌株對初始pH要求差異很大，如白腐菌basidiomiceteTrametes trogii(MYA 28－11)在pH4.5時(shí)，產(chǎn)木質(zhì)素酶活力最強(qiáng)［8］。假單胞菌Pseudomonas sp.PKE117在pH5.5時(shí)，產(chǎn)木質(zhì)素酶活力最強(qiáng)［9］。粗壯脈紋孢菌Neurospora crassa在pH4.8時(shí)，產(chǎn)纖維素酶活力最強(qiáng)［10］。即使同為芽孢桿菌屬細(xì)菌，其最適pH也存在差異。短小芽孢桿菌Bacillus pumilusE2在pH6.0時(shí)，產(chǎn)纖維素酶活力最強(qiáng)［11］，Bacillus velezensisCXB001 產(chǎn)纖維素酶活力的最適pH為5.0［12］。

圖7 發(fā)酵時(shí)間 (e)和接種量 (f)對酶活的影響Fig.7 Effects of time(e)、inoculum size(f)on lignin and cellulose activity

在本試驗(yàn)中，pH對同一株菌產(chǎn)生的木質(zhì)素酶及纖維素酶活力不盡相同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，木質(zhì)素酶活力受pH影響較大，pH8.0時(shí)菌株生長良好，但pH9.0時(shí)菌株酶活力急劇下降，而纖維素酶活力在pH5.0～8.0時(shí)，活力較穩(wěn)定。由此可知，不同酶對pH的要求不同，即使是同一株菌所產(chǎn)生酶類對pH要求也有差異。但本試驗(yàn)菌株兩種酶的最適pH均為8.0，這可能與兩種酶的活性中心氨基酸組成有關(guān)，但目前并無相關(guān)報(bào)道，其原因有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)采用Azure-B平板法及剛果紅培養(yǎng)基法篩選白蟻腸道中的木質(zhì)纖維素分解菌，生化試驗(yàn)結(jié)合16S rRNA方法對菌株種屬進(jìn)行鑒定，達(dá)到了快速、有效的鑒定分類的目的。本試驗(yàn)同時(shí)測定了不同碳源、氮源、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及接種量等對酶活最強(qiáng)菌株MX5產(chǎn)酶活力影響，通過改變條件使菌株產(chǎn)酶量增加，這將對提高木質(zhì)纖維素的利用率具有十分重要的意義。

目前，對于白蟻腸道中纖維素酶基因的克隆已有相關(guān)報(bào)道［13］，但對于木質(zhì)素酶基因的克隆還鮮有報(bào)道，故從白蟻腸道中獲得降解木質(zhì)素的相關(guān)基因，并對其開展深入研究，充分利用木質(zhì)素酶分解自然界中廣泛存在的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，發(fā)展第三代生物質(zhì)能源，意義深遠(yuǎn)。

［1］SáNCHEZ C.Lignocellulosic residues:Biodegradation and bioconversion by fungi［J］.Biotechnol Adv，2009，27:185－194.

［2］ROTHSCHILD N，NOYOTNY，VáCLAV ?，et al.Ligninolytic enzymes of the fungusIrpex lacteus(Polyporus tulipiferae):Isolation and characterization of lignin peroxidase［J］.Enzyme MicrobTechnol，2002，31:627－633.

［3］VARMA A，KOLLI B K，PAUL J，et al.Lignocellulose degradation by microorganisms from termite hills and termite guts:A survey on the present state of art［J］.FEMS Microbiol Rev，1994，15(1):9－28.

［4］周剛.白蟻內(nèi)生菌的分離及其纖維素酶/木質(zhì)素酶高產(chǎn)菌株的鑒定［D］.哈爾濱:黑龍江大學(xué)，2006:22－35.

［5］金劍，康文麗，生吉萍，等.云芝(Coriolus versicolor)木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)酶學(xué)性質(zhì)分析［J］.食品科學(xué)，2010，31(17):224－227.

［6］姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:36－42.

［7］張桂山.吉林白鵝腸道纖維分解菌分離鑒定的研究［D］.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007:9－21.

［8］LEVIN L，HERRMANN C，PAPINUTTI V L.Optimization of lignocellulolytic enzyme production by the whiterot fungusTrametes trogiiin solid-state fermentation using response surface methodology［J］.Biochem Eng J，2008，39:207－214.

［9］楊金水，袁紅莉，李寶珍，等.假單孢菌PKE117木素過氧化物酶的酶學(xué)性質(zhì)及基因克?。跩］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，43(4):567－571.

［10］吳丹，鄧澤元，范亞葦，等.一株纖維素分解菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2008，29(06):218－221.

［11］高云航，張喜宏，劉佳麗，等.鵝腸道纖維素分解菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(3):466－472.

［12］鄧先余，鄒謀勇，黃志堅(jiān)，等.一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離鑒定及其酶學(xué)特性研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，51(5):93 －99.

［13］ZHOU X G，SMITH J A，Oi F M，et al.Correlation of cellulase gene expression and cellulolytic activity throughout the gut of the termiteReticulitermes flavipes［J］.Gene，2007，395(1/2):29 －39.