張穎倩，胡舜英，陳韻岱

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管最內(nèi)層細(xì)胞，直接接觸血液，具有保持血管的完整性與穩(wěn)定性，抗血小板聚集、維持血管張力等生理功能。心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)與大血管內(nèi)皮細(xì)胞及各臟器微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間表現(xiàn)出不同的功能異質(zhì)性［1］。CMECs可通過(guò)分泌活性物質(zhì)直接影響心肌細(xì)胞［2］，并參與缺血/再灌注損傷［3］、無(wú)復(fù)流現(xiàn)象等病理生理過(guò)程。原代CMECs的分離培養(yǎng)對(duì)研究缺血/再灌注損傷、微血管功能障礙、冠心病的治療等有重要意義。本實(shí)驗(yàn)在Peters實(shí)驗(yàn)［4］的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，在保證細(xì)胞純度的前提下進(jìn)一步提高了CMECs的收獲率，成功分離并培養(yǎng)了純度、成活率均較高的原代CMECs。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)，超凈臺(tái)(北京亞泰科隆)，酶標(biāo)儀(Biotec)，搖床(北京歐諾)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，流式細(xì)胞儀(B＆D)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SD大鼠乳鼠，5～7 d，體重12～15 g，雌雄不限，購(gòu)自解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001。高糖DMEM干粉(Gibco)，Ⅰ型膠原酶(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，PBS(Hyclone)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Hyclone)，重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，中科物源)，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(中杉金橋)，兔抗鼠CD31多克隆抗體(中杉金橋)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(中杉金橋)，AnnexinⅤ-FITC＆PI凋亡檢測(cè)試劑盒(嘉美生物)，二甲基亞砜(DMSO，Gibco)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳鼠CMECs的分離與培養(yǎng):乳鼠脫臼處死，無(wú)菌條件下取左心室，放入冰浴PBS+肝素鈉溶液中，眼科剪和眼科鑷去除左心室外1/4層組織、心內(nèi)膜、心外膜及瓣膜。沿室間隔剪開(kāi)左心室，95%乙醇浸泡20 s，滅活殘余的心內(nèi)膜和心外膜細(xì)胞。PBS沖洗，將心肌組織剪為 0.5 mm ×0.5 mm ×0.5 mm的組織塊。加0.2%Ⅰ型膠原酶5 ml，置于搖床內(nèi)37℃振蕩水浴20 min，吹打后加入0.25%胰酶5 ml，37℃振蕩水浴5 min，再次吹打。200目金屬篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液用等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基(90%DMEM+10%胎牛血清)中和，1000 r/min離心8 min。棄上清收集沉淀細(xì)胞，細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，去除懸浮的未貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基(80%DMEM+20%胎牛血清+10 ng/ml VEGF+100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素)繼續(xù)培養(yǎng)已貼壁的CMECs。48 h更換一次完全培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋80%培養(yǎng)面時(shí)，0.25%胰酶消化，按1∶2比例傳代。

1.3.2 細(xì)胞免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定:將蓋玻片平放于24孔板中，細(xì)胞懸液調(diào)整至1×105個(gè)/ml滴加于蓋玻片上，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋80%培養(yǎng)面后，取出細(xì)胞爬片;PBS洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定20 min;PBS洗3次，每次5 min;5%牛白蛋白室溫封閉30 min;分別在兩張細(xì)胞爬片上滴加兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(1:100)和兔抗鼠CD31多克隆抗體(1:100)，陰性對(duì)照細(xì)胞爬片滴加等量PBS，放入濕盒內(nèi)，37℃孵育4 h;PBS洗3次，每次5 min;于3張細(xì)胞爬片上分別滴加山羊抗兔IgG-FITC，37℃避光孵育30 min;PBS洗3次，每次5 min［5］。立即于倒置熒光顯微鏡下觀察，每張爬片計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算其平均數(shù)。

1.3.3 臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率及AnnexinⅤ＆PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋80%培養(yǎng)面時(shí)，0.25%胰酶消化，用等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基(90%DMEM+10%胎牛血清)中和，1000 r/min離心8 min。棄上清收集沉淀細(xì)胞，細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，并吹打均勻。90 μl細(xì)胞懸液與10 μl 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，染色3 min，于倒置相差顯微鏡下觀察，死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞呈無(wú)色透明狀［6］。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力:活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。重復(fù)3次，取其平均值。細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋80%培養(yǎng)面時(shí)，0.25%胰酶消化，用等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基中和，1000 r/min離心8 min。棄上清收集(1～5)×105細(xì)胞，用預(yù)冷PBS(4℃)重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，加500 μl Binding buffer 重懸，加入 5 μl AnnexinⅤ-FITC染液混勻并避光，室溫孵育15 min;加入5 μl PI染色5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及存活率［7］。重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.4 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:細(xì)胞按104/孔接種于 96孔板中培養(yǎng) 24 h，向4復(fù)孔中加入5 mg/ml MTT 溶液 10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;棄掉培養(yǎng)基，每孔加入 150 μl DMSO，避光振蕩 10 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光吸收值［8］。每24 h測(cè)定4復(fù)孔的光吸收值。計(jì)算每個(gè)復(fù)孔吸光度平均值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 CMECs培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞貼壁培養(yǎng)4 h后棄去上清，PBS沖洗后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。原代乳鼠CMECs培養(yǎng)24 h可見(jiàn)短梭形、三角形、多邊形細(xì)胞聚集呈管腔樣生長(zhǎng)。72 h見(jiàn)原代培養(yǎng)乳鼠CMECs鋪滿，呈鋪路石樣，見(jiàn)圖1。鋪路石樣及管腔樣生長(zhǎng)皆為血管內(nèi)皮細(xì)胞的典型生長(zhǎng)特點(diǎn)。

圖1 光鏡觀察乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果(×40)

2.2 CMECs鑒定結(jié)果 在倒置熒光顯微鏡下觀察，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體免疫熒光染色后，胞漿內(nèi)呈綠色熒光，見(jiàn)圖2。兔抗鼠CD31多克隆抗體免疫熒光染色后，胞膜呈綠色熒光，見(jiàn)圖3。陰性對(duì)照細(xì)胞不能觀察到熒光。Ⅷ因子及CD31雙陽(yáng)性證實(shí)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞，雙陽(yáng)性者＞95%。分離培養(yǎng)的乳鼠CMECs純度很高。

2.3 CMECs臺(tái)盼藍(lán)染色及AnnexinⅤ＆PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，計(jì)數(shù)活細(xì)胞率平均值＞95%，25 cm2培養(yǎng)瓶細(xì)胞數(shù)達(dá)7×106/瓶。AnnexinⅤ＆PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)存活細(xì)胞率＞95%，見(jiàn)圖4。

圖2 乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體免疫熒光染色×200)圖3 乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(兔抗鼠CD31多克隆抗體免疫熒光染色×200)

圖4 AnnexinⅤ-FITC＆PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞存活率

2.4 CMECs生長(zhǎng)曲線 MTT法連續(xù)11 d檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖5。于培養(yǎng)3～5 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng) 5～7 d為生長(zhǎng)平臺(tái)期。

圖5 乳鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討論

目前，培養(yǎng)原代CMECs的方法主要有磁珠篩選法［9］、植塊培養(yǎng)法［10-12］和雙酶消化法［4，13］。磁珠篩選法對(duì)儀器、技術(shù)要求較高，需要連接有抗體的磁珠，成本高且細(xì)胞收獲率低。植塊培養(yǎng)法分離操作較簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件無(wú)特殊要求，分離細(xì)胞成本低，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，原代細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋80%培養(yǎng)面需5 ～7 d，且培養(yǎng)皿需用鼠尾膠原［14］或明膠［15］等處理以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的爬出與貼壁，增加了操作步驟及污染概率。Peters等［4］采用雙酶消化法分離并純化原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)物理法、化學(xué)法、差速貼壁法純化內(nèi)皮細(xì)胞，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得純度較高的原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞。心臟組織的內(nèi)皮細(xì)胞分為大血管壁內(nèi)皮細(xì)胞，微血管內(nèi)皮細(xì)胞和心內(nèi)膜、心外膜內(nèi)皮細(xì)胞，三者在功能與結(jié)構(gòu)上均存在著異質(zhì)性［16-17］。為了得到高純度的 CMECs，心內(nèi)膜、心外膜內(nèi)皮細(xì)胞和大血管壁內(nèi)皮細(xì)胞是必須去除的。在Peters的實(shí)驗(yàn)中，剪除心房、瓣膜、右心室、室間隔、心內(nèi)膜以去除心內(nèi)膜、心外膜內(nèi)皮細(xì)胞;剪除左心室外1/4層心肌以去除心外膜及大血管內(nèi)皮細(xì)胞。將剩余組織于95%乙醇中處理，進(jìn)一步滅活剩余的心內(nèi)膜和心外膜內(nèi)皮細(xì)胞。使用膠原酶孵育使心臟組織松散，吹打過(guò)程促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞的分離。胰酶與膠原酶共同孵育消化，能促進(jìn)破壞成纖維細(xì)胞。并根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁較心肌細(xì)胞貼壁快的原理，在內(nèi)皮細(xì)胞大量貼壁后，去除上清并用預(yù)熱的PBS沖洗，將貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，利用差速貼壁法純化微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)在Peters實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)步驟:①選用5～7 d齡的SD乳鼠，細(xì)胞的增殖分裂能力較3月齡的大鼠細(xì)胞強(qiáng)。雖然對(duì)心臟的解剖及心房、瓣膜、右心室、室間隔、心內(nèi)膜及左心室外1/4層心肌的去除操作要求較高，但練習(xí)后可以較好完成。②將其實(shí)驗(yàn)中膠原酶的孵育時(shí)間自10 min延長(zhǎng)至20 min，并置于180 g/min、37℃的搖床孵育，增加了組織塊與膠原酶的接觸時(shí)間與面積，進(jìn)一步促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞與非內(nèi)皮細(xì)胞的分離。③將初次分離的細(xì)胞懸液培養(yǎng)時(shí)間自1 h延長(zhǎng)至4 h后去除上清，增加了貼壁的細(xì)胞數(shù)量。且經(jīng)Ⅷ因子及CD31雙鑒定純度＞95%，在保證純度的前提下提高了CMECS的收獲率。④有研究指出，心肌成纖維細(xì)胞的分裂增殖速度較微血管內(nèi)皮細(xì)胞快［18］，故于培養(yǎng)基中加入10 ng/ml VEGF促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，可對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)造成抑制，以提高微血管內(nèi)皮細(xì)胞的純度。⑤成纖維細(xì)胞貼壁較微血管內(nèi)皮細(xì)胞牢固，在傳代過(guò)程中，采用差速消化法，于0.25%胰酶消化2 min時(shí)及時(shí)終止消化，可以進(jìn)一步去除貼壁較牢的成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)成功分離并培養(yǎng)了純度、成活率均較高的原代CMECs，為缺血/再灌注損傷、微血管功能障礙、冠心病相關(guān)治療等的體外研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Aird W C.Endothelial cell heterogeneity［J］.Critical Care Medicine，2003，31(4 Suppl):221-230.

［2］Nie L，Wise M L，Peterson D M，et al.Avenanthramide，a polyphenol from oats， inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and enhances nitric ox-ide production［J］.Atherosclerosis，2006，186(2):260-266.

［3］Ono T，Tsuruta R，F(xiàn)ujita M，et al.Xanthine oxidase is one of the major sources of superoxide anion radicals in blood after reperfusion in rats with forebrain ischemia/reperfusion［J］.Brain Research，2009，1305(11):158-167.

［4］Peters S C，Reis A，Noll T.Preperation of Endothelial Cells from Micro-and Macrovascular Origin［M］//Dhein S，Mohr F W，Delmar M.Practical methods in cardiovascular research.1st ed.Berlin Heidelberg:Springer，2005:610-629.

［5］Pearlstein D P，Ali M H，Mungai P T.Role of mitochondrial oxidant generation in endothelial cell responses to hypoxia［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(4):566-573.

［6］Zhao J，Bolton E M，Bradley J A.Lentiviral-mediated overexpression of Bcl-xL protects primary endothelial cells from ischemia/reperfusion injury-induced apoptosis［J］.J Heart Lung Transplant，2009，28(9):936-943.

［7］Dong Q，Yang Y，Song L.Atorvastatin prevents mesenchymal stem cells from hypoxia and serum-free injury through activating amp-activated protein kinase［J］.International Journal of Cardiology，2011，153(3):311-316.

［8］Song J，Liu K，Yi J.Luteolin inhibits lysophosphatidylcholine-induced apoptosis in endothelial cells by a calcium/mitocondrion/caspases-dependent pathway［J］.Planta Med，2010，76(5):433-438.

［9］Bowden R A，Ding Z M，Donnachie E M，et al.Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium［J］.Circulation Research，2002，90(5):562-569.

［10］寧艷霞，王新紅，金惠銘，等.大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及基因芯片分析的研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21(12):2295-2300.

［11］張濤，滕可導(dǎo)，田啟超，等.乳鼠心肌膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)［J］.解剖學(xué)報(bào)，2008，39(1):121-123.

［12］顏春曉，盛修貴，杜雪蓮.免疫磁珠法原代分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及鑒定［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(8):561-565.

［13］Peters S C，Piper H M.Reoxygenation-induced Ca2+rise is mediated via Ca2+influx and Ca2+release from the endoplasmic reticulum in cardiac endothelial cells［J］.Cardiovascular Research，2007，73(1):164-171.

［14］滕麗新，劉勝學(xué)，謝庭菊，等.大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(4):403-405.

［15］康煥菊，曹蘇，沈施仁.原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法優(yōu)化［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(23):3032-3034.

［16］何秀娟，呂喆，龍軍，等.瘍愈涂劑對(duì)人白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附影響的分子機(jī)制［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(6):752-755.

［17］王鈜，樓敏，榮光華，等.內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)及攜帶基因腺病毒轉(zhuǎn)染后生物活性變化的觀察［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(22):1712-1715.

［18］Nishida M，Carley W W，Gerritsen M E，et al.Isolation and characterization of human and rat cardiac microvascular endothelial cells［J］.Am J Physiol，1993，264(2):639-652.