王飛杜蕓蘭衛(wèi)立辛李焰生

α-突觸核蛋白異常聚集形成的寡聚體在帕金森病(Parkinson's disease，PD)的發(fā)病過程中起重要作用，它使胞漿內(nèi)游離的多巴胺增多，也可以誘導(dǎo)線粒體功能紊亂，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡[1]。已有研究顯示，在PD果蠅模型中，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 6，HDAC6)基因的敲除能加重神經(jīng)元的退行性變，這可能與α-突觸核蛋白寡聚體水平的升高有關(guān)[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬制作異常蛋白質(zhì)聚集的PD模型，觀察抑制HDAC6對(duì)α-突觸核蛋白寡聚體及熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的影響，以探究HDAC6缺乏是否通過調(diào)節(jié)HSP的表達(dá)而影響寡聚體的水平。本研究結(jié)果將為明確HDAC6在PD發(fā)病中的作用以及探索其應(yīng)用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液中，含10%胎牛血清及1%青/鏈霉素。細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3～4 d換液，單層細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)使用0.05%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 α-突觸核蛋白基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞α-突觸核蛋白重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、測(cè)序后大量抽提質(zhì)粒DNA，并使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)將其轉(zhuǎn)入SK-N-SH細(xì)胞。之后用含500 μg/mL G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，待細(xì)胞克隆成團(tuán)，將其挑至96孔板中培養(yǎng)，鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)于含250 μg/mL G418的完全培養(yǎng)基中。

1.3 噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率將lactacystin(Calbiochem，德國)、tubacin(Enzo，美國)溶于二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)中備用。轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，并設(shè)DMSO對(duì)照組、lactacystin組、tubacin+lactacystin組和tubacin組。lactacystin 組終濃度為 5 μmol/L[3]，tubacin 組設(shè) 1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L四個(gè)濃度組。24 h后，每孔換100μL新鮮培養(yǎng)液，并加入20 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后去除培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，搖床低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。

1.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)α-突觸核蛋白及其寡聚體、HSP70及HSP27的表達(dá)水平提取各組細(xì)胞蛋白，煮沸5 min后按每組40 μg上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(Poly vinylidene fluoride，PVDF)膜，室溫封閉 1 h后加抗α-突觸核蛋白(1：1000，sigma，美國)、HSP70(1：1000，Cell Signaling Technology，美國)或HSP27(1：5000，Santa Cruz，美國)抗體，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后加入相應(yīng)二抗(1：5000～1：10000，Li-cor，美國)，室溫孵育1 h后，紅外熒光掃描檢測(cè)膜上蛋白的表達(dá)。

1.5 斑點(diǎn)印跡雜交法(Dot blot)檢測(cè)寡聚體水平取各組蛋白各3 μL點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，風(fēng)干后室溫封閉 1 h，加抗寡聚體(1：3000，Invitrogen，美國)抗體，4℃孵育過夜。次日洗膜后，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，用紅外熒光掃描檢測(cè)寡聚體的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，行方差齊性檢驗(yàn)與單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)，多組之間均數(shù)兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞α-突觸核蛋白表達(dá)的鑒定Western blot結(jié)果顯示α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)染組較空載體轉(zhuǎn)染組α-突觸核蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)，提示α-突觸核蛋白基因成功轉(zhuǎn)入SKN-SH細(xì)胞并表達(dá)(見圖1)。

2.2 不同濃度HDAC6抑制劑對(duì)細(xì)胞存活率的影響 與DMSO對(duì)照組相比，lactacystin組細(xì)胞活力明顯降低，加入tubacin后的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低。不同濃度tubacin組(1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)組間相比，濃度越高，細(xì)胞存活率越低(P＜0.05)，但 1 μmol/L tubacin+lactacystin 組與lactacystin組、20 μmol/L tubacin+lactacystin組與10 μmol/L tubacin+lactacystin組細(xì)胞存活率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。故選用10 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)tubacin的用藥濃度。不含lactacystin的不同濃度tubacin處理的細(xì)胞組與DMSO對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見圖2)

2.3 抑制HDAC6對(duì)寡聚體及α-突觸核蛋白寡聚體水平的影響與DMSO對(duì)照組相比，lactacystin使寡聚體增多，抑制HDAC6后lactacystin組細(xì)胞寡聚體水平進(jìn)一步升高。同樣，只用HDAC6抑制劑處理的細(xì)胞與DMSO對(duì)照組細(xì)胞相比，寡聚體水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3)。

α-突觸核蛋白單體分子量為19kD，病理狀態(tài)下折疊為不同分子量的寡聚體形式。使用western blot檢測(cè)4組細(xì)胞中α-突觸核蛋白寡聚體水平，結(jié)果顯示α-突觸核蛋白寡聚體的變化與總寡聚體的變化趨勢(shì)相一致，見圖4。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖4)。

圖1 Western blot鑒定α-突觸核蛋白的表達(dá) 。

圖2 MTT檢測(cè)不同濃度HDAC6抑制劑對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

2.4 抑制HDAC6對(duì)HSP70及HSP27表達(dá)水平的影響 與DMSO對(duì)照組相比，lactacystin組的HSP70及HSP27表達(dá)水平升高(P＜0.05)，但加入tubacin后其表達(dá)水平均較lactacystin組顯著降低(P＜0.05)。單用Tubacin處理的對(duì)照組細(xì)胞與DMSO對(duì)照組細(xì)胞相比，HSP表達(dá)量無明顯差異(P＞0.05，見圖5)。

圖3 Dot blot檢測(cè)抑制HDAC6對(duì)寡聚體水平的影響。

3 討論

帕金森病的主要病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失和殘存神經(jīng)元中出現(xiàn)包涵體[4]。包涵體的主要成分是α-突觸核蛋白，其異常聚集形成的寡聚體是引起神經(jīng)退行性變的毒性形式[5]，故以影響α-突觸核蛋白寡聚體的因素為靶點(diǎn)的研究具有重要價(jià)值。

本研究采用的PD細(xì)胞模型中，胞內(nèi)含有大量α-突觸核蛋白寡聚體，體現(xiàn)了PD的病理學(xué)特征，說明此模型可以為后續(xù)深入研究PD發(fā)病機(jī)制及可能治療靶點(diǎn)提供新的平臺(tái)。在本研究中，PD模型細(xì)胞的HDAC6活性被抑制后，α-突觸核蛋白寡聚體水平升高、細(xì)胞存活率降低，說明抑制HDAC6將加重?fù)p害。與此結(jié)果相似的是，Du等[2]在PD果蠅模型中通過免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)，HDAC6敲除使α-突觸核蛋白寡聚體數(shù)量增多，從而誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的丟失。但本實(shí)驗(yàn)使用的蛋白免疫印跡法將α-突觸核蛋白寡聚體量化，能更加直觀、深入地體現(xiàn)其表達(dá)水平的變化，且PD模型細(xì)胞來源于人，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能更真實(shí)地反映各因子在PD發(fā)病及進(jìn)展過程中的改變。

圖4 Western blot檢測(cè)抑制HDAC6對(duì)α-突觸核蛋白寡聚體水平的影響。

圖5 Western blot檢測(cè)抑制HDAC6對(duì)HSP70及HSP27表達(dá)水平的影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PD細(xì)胞模型的HSP70及HSP27表達(dá)水平均明顯升高，而抑制HDAC6則使兩者的水平有不同程度減少。由于HSP70、HSP27可以抑制α-突觸核蛋白聚集導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡[6，7]，我們推測(cè)，抑制HDAC6可能通過下調(diào)HSP的表達(dá)減少了異常蛋白質(zhì)的修復(fù)和清除，從而使α-突觸核蛋白異常聚集增加。

在對(duì)其他神經(jīng)變性疾病中的研究中，發(fā)現(xiàn)HDAC6抑制劑具有雙向作用，一方面可以抑制異常聚集蛋白質(zhì)的降解，產(chǎn)生神經(jīng)毒性；另一方面促進(jìn)了線粒體、吞噬結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，從而起保護(hù)作用[8，9]。HDAC6抑制劑在PD中是否也可以通過其他途徑影響多巴胺能神經(jīng)元尚不可知。因此，對(duì)此方面的探索將可能成為PD研究領(lǐng)域中的新方向。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示HDAC6抑制劑使異常蛋白質(zhì)聚集的PD細(xì)胞模型中HSP70和HSP27的水平明顯降低、α-突觸核蛋白寡聚體數(shù)量增多、細(xì)胞存活率下降。結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)HDAC6在蛋白質(zhì)降解受阻的PD模型中表達(dá)水平的升高[10]，我們可以推測(cè)，PD模型中HDAC6水平的升高可能通過調(diào)節(jié)HSP的表達(dá)參與錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)構(gòu)的調(diào)整或修復(fù)，是一種細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)。因此，對(duì)HDAC6的研究將為深入研究PD的發(fā)病機(jī)制提供潛在的新靶點(diǎn)和新思路，具有重要意義。但上調(diào)HDAC6的水平對(duì)此PD模型是否有保護(hù)作用尚不可知，這也將成為我們進(jìn)一步的研究方向。

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