王曉婷梁志堅陳莉黨超曾進(jìn)勝

腦梗死后神經(jīng)功能的重建一直是臨床治療的重點(diǎn)與最終目標(biāo)。實(shí)驗(yàn)研究[1,2]顯示，梗死灶周圍神經(jīng)干細(xì)胞的增生、分化以及毛細(xì)血管的再生等，都可能是實(shí)驗(yàn)動物神經(jīng)功能恢復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)性單側(cè)腦外傷后，損傷對側(cè)(健側(cè))皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract,CST)會不同程度發(fā)生新生纖維，在脊髓平面實(shí)現(xiàn)纖維重新分布，提示CST結(jié)構(gòu)重塑也可能參與神經(jīng)功能重建[3,4]。然而因發(fā)病機(jī)制不同，腦梗死后是否存在梗死對側(cè)(健側(cè))CST重構(gòu)，需要進(jìn)一步觀察。本研究采用生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)順行性神經(jīng)纖維示蹤技術(shù)，在解剖結(jié)構(gòu)上觀察大鼠實(shí)驗(yàn)性腦皮層梗死后，健側(cè)CST纖維發(fā)生重塑的現(xiàn)象，并進(jìn)一步探討其在腦梗死模型中神經(jīng)功能重建過程的作用。

1 材料與方法

1.1 模型大鼠的制作 采用7～9周、體質(zhì)量70～90g的雄性Sprague-Dawley大鼠，按雙腎雙夾法復(fù)制易卒中型腎血管性高血壓模型[5]。術(shù)后12周，選取收縮壓180mmHg以上，無自發(fā)性卒中大鼠12只，隨機(jī)取6只經(jīng)電凝法[6]行右側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)，余6只僅暴露中動脈不凝閉，入假手術(shù)組。

1.2 BDA順行示蹤標(biāo)記 造模后14d，參照Zai等[7]方法予兩組大鼠左側(cè)運(yùn)動皮層BDA注射。大鼠10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔麻醉，立體定位儀頭部固定，取頂部正中縱行切口，沿顱中線用咬骨鉗向左咬成4mm×7mm的骨窗，微量注射器選運(yùn)動區(qū)、進(jìn)針皮層內(nèi)2mm、緩慢注射10%BDA溶液0.2μL，完畢后封閉骨窗縫合。見圖1A、B。

1.3 神經(jīng)功能評分根據(jù)Ding等[8]腳步錯誤試驗(yàn)，計算大鼠左前肢通過一長方形網(wǎng)格(10cm×110cm)腳步滑脫的次數(shù)比值，數(shù)目越大說明神經(jīng)功能越差。大鼠于檢測前3d訓(xùn)練，術(shù)前1d(術(shù)后-1d)、術(shù)后3d、14d、28d檢測，每只大鼠均測量3次取均值作為該時間點(diǎn)神經(jīng)功能評分。

1.4 腦組織準(zhǔn)備 BDA注射后14d，兩組大鼠按上述方法麻醉。4℃生理鹽水經(jīng)升主動脈快速灌注，4℃4%多聚甲醛滴注固定約1h，斷頭取腦及脊髓。后固定24h，20%、30%梯度蔗糖溶液脫水，OCT包埋。經(jīng)延髓、高頸髓(C1-2)冠狀冰凍連續(xù)切片，片厚50μm，部分頸髓10μm，待后續(xù)處理。

1.5 BDA免疫檢測 厚切片置于12孔板，依次孵育于 0.3%H2O230min、0.3%TritonX-10030min、抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合液(standard Elit ABC kit,Vector Labs)4℃過夜；次日于含4%硫酸鎳胺的二氨基聯(lián)苯胺(BDA,Dako)中顯影10min，遂裱片、風(fēng)干、脫水及封片。

1.6 BDA與GAP-43免疫雙染頸髓薄切片于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液、微波加熱抗原修復(fù)5min，依次孵育于0.3%TritonX-10030min、5%牛血清蛋白1h、小鼠抗大鼠神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43(growth-associated protein 43,GAP-43)抗體(1：400，millipore)4℃過夜。次日室溫下孵育于Alexa 594偶聯(lián)驢抗小鼠抗體(1：500，invitrogen)/Alexa 488偶聯(lián)鏈酶親和素(1：500，invitrogen)1h，封片。

1.7 圖片采集與計數(shù)采用BX51系統(tǒng)生物顯微鏡采集圖片，通過Image-Pro-Plus 6.0軟件行BDA陽性纖維計數(shù)。①延髓水平BDA陽性纖維總數(shù)：在10×10倍視野下，計算BDA標(biāo)記側(cè)(健側(cè))的BDA陽性纖維數(shù)，每只大鼠測3個隨機(jī)平面取均值作為該大鼠延髓水平BDA陽性纖維數(shù)，共6只大鼠，再算其均數(shù)作為該組大鼠延髓水平BDA陽性纖維總數(shù)；②非標(biāo)記側(cè)(梗死皮層支配側(cè))頸髓灰質(zhì)內(nèi)BDA陽性纖維數(shù)量比值：在10×10倍視野下，以通過中央管中點(diǎn)的直線為中線，計數(shù)所有越過中線并出現(xiàn)在非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的BDA陽性纖維數(shù)，每只大鼠測25個隨機(jī)平面的BDA陽性纖維數(shù)取均值，共6只大鼠，再算其均值，最后除以該組延髓BDA陽性纖維總數(shù)；③非標(biāo)記側(cè)頸髓CST的分布范圍：在10×10倍視野下，同②分別計數(shù)距中央管中心：100μm、300μm、600μm及900μm界線發(fā)生交匯的BDA陽性纖維數(shù)比值；④相關(guān)分析雙變量：MCAO組每只大鼠健側(cè)CST芽生纖維數(shù)量，即參照②計算方法，每只大鼠非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)BDA陽性纖維數(shù)量減去假手術(shù)組6只大鼠同區(qū)域的BDA陽性纖維數(shù)均值；另外計算該只大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)程度，即功能評分[(d3-d28)/d3]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0分析。計量資料以x±s表示，組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。雙變量用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 延髓CST纖維 兩組大鼠標(biāo)記側(cè)延髓均可見CST被染成黑色，纖維排列整齊、致密、呈梭型，統(tǒng)計結(jié)果示MCAO組(2190.67±94.12)與假手術(shù)組(2205.67±96.81)CST纖維總數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.272，P＞ 0.05)，見圖1 C、D。

2.2 非標(biāo)記側(cè)頸髓BDA陽性纖維 兩組大鼠頸髓平面均可見黑染的BDA陽性纖維由健側(cè)(BDA標(biāo)記側(cè))CST發(fā)出，在灰質(zhì)前、后聯(lián)合處越過中線，到達(dá)對側(cè)(非標(biāo)記側(cè))灰質(zhì)區(qū)域，見圖1E、F，而且MCAO組BDA陽性纖維可以分布到更遠(yuǎn)的區(qū)域，有時還可以看到纖維上出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣膨大，見圖2A、B、C、D。BDA與GAP-43免疫雙染色顯示，非標(biāo)記側(cè)頸髓灰質(zhì)區(qū)BDA陽性纖維，同時表達(dá)GAP-43，見圖3。

統(tǒng)計結(jié)果示，MCAO組BDA陽性纖維數(shù)比值(11.90×10-4±1.46×10-4)較假手術(shù)組(3.77×10-4±0.73×10-4)增加(t=13.30，P＜ 0.001)。而且，MCAO組分別在距離中心各個距離界線的BDA陽性纖維數(shù)比值較假手術(shù)組均增加，見表1。

2.3 大鼠神經(jīng)功能評分 與假手術(shù)組比較：MCAO組大鼠術(shù)前神經(jīng)功能良好，術(shù)后各時間點(diǎn)功能缺失明顯；MCAO組大鼠術(shù)后3d神經(jīng)功能缺失最嚴(yán)重，之后逐漸恢復(fù)，見表2。Pearson相關(guān)分析顯示，MCAO組每只大鼠術(shù)后功能恢復(fù)的程度，與其對應(yīng)的每只大鼠健側(cè)CST芽生纖維的數(shù)量，呈正相關(guān)(r=0.88,P＜0.05)。

圖1 A：BDA注射點(diǎn)示意圖;B：皮質(zhì)脊髓束(CST)纖維走向及芽生纖維示意圖;C(假手術(shù)組)/D(MCAO組)：延髓BDA標(biāo)記纖維數(shù)，圖中顯示兩側(cè)CST數(shù)量和形態(tài)無明顯差別，(標(biāo)尺：200μm);E(假手術(shù)組)/F(MCAO組)：頸髓BDA標(biāo)記陽性纖維圖中箭頭所示，標(biāo)尺：70μm)，圖中顯示MCAO組纖維數(shù)明顯多于假手術(shù)組

圖 2 A：BDA陽性纖維在非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的空間分布示意圖。虛線表示中線，箭頭指示為BDA陽性纖維;B：(假手術(shù)組);C：(MCAO組)均可發(fā)現(xiàn)BDA標(biāo)記纖維分布到非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)，箭頭所示為BDA標(biāo)記纖維(標(biāo)尺：150μm)，圖中顯示與假手術(shù)組比較，MCAO組BDA陽性纖維數(shù)明顯增多，而且分布到更遠(yuǎn)的部位;D：C的局部放大，箭頭所示為BDA陽性纖維上的結(jié)節(jié)樣突觸小體(標(biāo)尺：20μm)

圖3 非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的BDA(綠色)與GAP-43(紅色)的雙重免疫熒光(黃色)染色。假手術(shù)組：A、B、C，MCAO組：D、E、F(標(biāo)尺：20μm)圖中顯示非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的BDA陽性纖維GAP-43表達(dá)陽性，同時MCAO組免疫雙染陽性纖維數(shù)明顯多于假手術(shù)組

表1 頸髓非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)與各條界線交匯的BDA陽性纖維數(shù)比值(x±s)

3 討論

3.1 腦梗死后健側(cè)CST發(fā)生重塑 BDA在皮層內(nèi)細(xì)胞外注射后，可被錐體細(xì)胞胞體攝取、經(jīng)軸突順行運(yùn)輸均勻分布于軸突或軸突分支遠(yuǎn)端，顯影后可清晰地觀察神經(jīng)纖維及其行程，是常用神經(jīng)示蹤劑。本研究使用BDA對健側(cè)CST進(jìn)行追蹤，首先在兩組大鼠延髓腹側(cè)見BDA陽性的CST，其纖維總數(shù)相同，說明兩組CST均沒發(fā)生變異。在此前提下，兩組大鼠才能科學(xué)比較位于頸髓非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的BDA標(biāo)記纖維。由于梗死側(cè)CST不存在BDA，故出現(xiàn)在非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)BDA陽性纖維被認(rèn)為是健側(cè)CST軸突發(fā)出的側(cè)枝纖維。本研究則證明了BDA陽性纖維起始于健側(cè)CST，繞過灰質(zhì)前、后聯(lián)合，延伸至對側(cè)灰質(zhì)內(nèi)各個板層。MCAO組BDA陽性纖維明顯多于假手術(shù)組，并且具有行程長、形成突觸樣結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。在正常生理?xiàng)l件下，頸髓CST存在小部分纖維交叉到對側(cè)形成雙側(cè)支配的現(xiàn)象，假手術(shù)組非標(biāo)記側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的BDA陽性纖維也證明了這一點(diǎn)，而MCAO組較假手術(shù)組增多的BDA陽性纖維，則應(yīng)該是腦梗死后誘發(fā)CST芽生形成的新纖維。GAP-43屬于神經(jīng)生長標(biāo)志物，主要分布于神經(jīng)生長錐內(nèi)。MCAO組BDA陽性纖維同時表達(dá)GAP-43，進(jìn)一步說明腦梗死后，健側(cè)CST芽生形成新纖維越過中線到達(dá)對側(cè)。Emerick等[3]在實(shí)驗(yàn)性大腦皮層損傷動物模型中發(fā)現(xiàn)，健側(cè)CST芽生纖維能越過脊髓中線終止于對側(cè)灰質(zhì)板層Ⅸ，并與前角α運(yùn)動神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系。在本研究中，位于頸髓前角灰質(zhì)BDA陽性纖維末梢呈現(xiàn)數(shù)個類似于Zai等[7]描述的結(jié)節(jié)樣突觸小體，提示該纖維可能與前角下運(yùn)動神經(jīng)元建立新的突觸聯(lián)系，具有執(zhí)行一定神經(jīng)功能的能力。

3.2 腦梗死后健側(cè)CST重塑的意義 本研究中，實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)過程中，MCAO組每只大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的程度與其頸髓CST芽生纖維數(shù)量呈正相關(guān)，提示健側(cè)CST的重塑可能參與了大鼠腦梗死后神經(jīng)功能的修復(fù)。

臨床上多數(shù)患者于腦梗死后可以自發(fā)表現(xiàn)程度不等的功能恢復(fù)，其機(jī)制至今尚未闡明。絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究[1，2]著重于梗死灶周圍神經(jīng)組織的重塑，并證實(shí)其參與了神經(jīng)功能恢復(fù)的部分機(jī)制。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，梗死面積過大、梗死病灶周圍瘢痕組織增生、血管再通或新生困難、遠(yuǎn)隔部位發(fā)生繼發(fā)性損害、神經(jīng)干細(xì)胞活化及分化不穩(wěn)定等因素都嚴(yán)重限制了梗死側(cè)神經(jīng)組織重塑的程度，并可能是部分患者神經(jīng)功能恢復(fù)不理想的可能原因[9]。然而，一側(cè)腦梗死發(fā)生后，健側(cè)大腦及CST不受上述因素影響，健側(cè)CST的重塑更具修復(fù)缺損的優(yōu)勢，有可能成為進(jìn)一步促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)的潛在目標(biāo)部位。在腦損傷動物模型中，健側(cè)CST軸突發(fā)芽、形成新生纖維越過脊髓中線到達(dá)對側(cè)脊髓前腳灰質(zhì)、形成突觸結(jié)構(gòu)，可能是動物神經(jīng)功能恢復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[3,10]。本研究，首次觀察到，MCAO大鼠健側(cè)CST新生性重塑，參與了動物神經(jīng)功能恢復(fù)的過程，為臨床上改善腦梗死患者神經(jīng)功能的研究，提供新的方法。

表2 大鼠腳步錯誤試驗(yàn)評分(x±s)

(本研究實(shí)驗(yàn)均在廣東省重大神經(jīng)疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成)

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