夏洪剛 葉劍飛 白宏宇 王長(zhǎng)利

肺癌是人類高發(fā)的惡性腫瘤，病死率在惡性腫瘤中居首位，其治療失敗和死亡的主要原因肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，新生血管的生成在肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著極其重要的作用[1,2]。近年來研究[3-6]表明水通道蛋白1（aquaporins 1, AQP1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體II/激酶功能區(qū)受體（vascular endothelial growth factor II , VEGFR2/kinase domain receptor, KDR）在許多腫瘤及其血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)升高，在促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖中起著關(guān)鍵作用。本研究以肺腺癌A549細(xì)胞株為研究對(duì)象，觀察表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）單克隆抗體西妥昔單抗、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）抑制劑塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)用時(shí)對(duì)體外肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡及KDR、AQP1基因和蛋白表達(dá)的影響，探討兩者的協(xié)同關(guān)系及其機(jī)制，以期為臨床治療肺癌提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞究所。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司。SPB購自德國Merck公司，塞來昔布（Celecoxib，江蘇恒瑞制藥有限公司），西妥昔單抗（Cetuximab，德國默克公司），青霉素（100 U/mL）（北京化工廠），鏈霉素（100 U/mL）（Peprotech），5%四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT溶液，上海華美生物工程公司）；流式細(xì)胞儀（COULTER XL, Coulter）；550酶標(biāo)儀（美國Biorad公司），生物倒置顯微鏡（Olympus CKX4）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5%CO2、37oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞以1×106個(gè)/100 mL培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)24 h后如下分組進(jìn)行藥物處理，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（PBS液1 mL處理組）；西妥昔單抗1 nmol/L組；塞來昔布25 μmol/L組；西妥昔單抗1 nmol/L+塞來昔布25 μmol/L組，藥物濃度見參考文獻(xiàn)[7,8]。

1.2.2 MTT比色實(shí)驗(yàn) 在96孔板上按5×104個(gè)/孔接種A549細(xì)胞，如1.2分組，每組設(shè)三個(gè)平行重復(fù)孔，置于37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，生理鹽水漂洗一遍，每孔加MTT 20 μL（濃度為5 mg/mL），放置孵箱內(nèi)4 h后棄上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸鈉）200 μL，過夜。震蕩15 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Biorad公司）檢測(cè)570 nm處的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集如1.2分組的不同處理組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/L，冷PBS 洗滌2次，加入70%的冷乙醇（4oC）固定24 h。洗滌細(xì)胞，與含10 μg/mL RNA 酶的Tris-HCL緩沖液（pH7.4）共同孵育30 min。50 μg/mL碘化丙啶進(jìn)行細(xì)胞DNA染色，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀（COULTER XL, Coulter）；分析細(xì)胞DNA含量分布，計(jì)算出各個(gè)周期細(xì)胞的百分率。

1.2.4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按如1.2分組處理過的A549細(xì)胞懸液100 μL（細(xì)胞總數(shù)為3×105個(gè)/L），置于培養(yǎng)箱中20 h后取出，用濕棉簽仔細(xì)擦掉上室中未穿過的瘤細(xì)胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗3遍，進(jìn)行HE染色，自然涼干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術(shù)刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上（膜內(nèi)面朝上），封片；高倍顯微鏡下記數(shù)穿膜的A549細(xì)胞數(shù)，每膜記數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，每組設(shè)三個(gè)濾膜。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)KDR、AQP1基因表達(dá) 將各組處理后的細(xì)胞懸液分別經(jīng)離心半徑16 cm、 800 rpm、離心5 min收集細(xì)胞，棄去上清后置于1 mL勻漿器中，加入1 mL Trizol試劑后研磨（冰盒上操作）。進(jìn)行RT-PCR分析。采用Trizol（Takara公司）試劑說明書介紹的方法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量，以總RNA為模板、Oligo（dT）為引物, 應(yīng)用RT-PCR兩步法試劑盒（TaKaRa公司）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)參數(shù)：30oC、10 min→2oC、30 min→99oC、5 min→5oC、5 min。所得cDNA -20oC保存。以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，相關(guān)引物序列見表1。上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL體系。擴(kuò)增參數(shù)：94oC、2 min→（94oC、30 s→55oC、30 s→72oC、30 s）×45循環(huán)→72oC、5 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后用FR200圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.6 Western blot檢測(cè)KDR、AQP1蛋白表達(dá) 在RT-PCR提取后剩余物中，加入適量裂解液及蛋白酶抑制劑，4oC、以1,500 rpm離心30 min，取上清液。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量后。將5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉(zhuǎn)14 V恒壓14 h，37oC搖床封閉2 h，洗膜10 min，3次，轉(zhuǎn)印后加入一抗：KDR多克隆抗體（1:1,000）或AQP1多克隆抗體4oC過夜（1:1,000）；抗鼠β-actin（1:5,000）4oC過夜。次日加入二抗山羊抗兔抗體（1:700），37oC搖床孵育1.5 h，TTBS洗3次×5 min，TBS洗3次×5 min。將硝酸纖維素膜用發(fā)光液（Pierce，A、B各100 μL）充分潤(rùn)濕后作用5 min，保鮮膜覆蓋，置暗盒中曝光5 min。顯影、水洗、定影后觀察結(jié)果，Quantity one圖像分析。目的條帶灰度值除以β-actin灰度值進(jìn)行結(jié)果分析。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

表 2 各組A549細(xì)胞OD490值（Mean±SD, n=9）Tab 2 OD490 value after Cetuximab and Celecoxib inhibit A549 (Mean±SD, n=9)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以Mean±SD表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，協(xié)方差校正，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 肺腺癌A549細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡觀察，可見細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分布密集，大多呈多角形，細(xì)胞走向趨于一致，多角形細(xì)胞的胞體飽滿、有2個(gè)-3個(gè)扁平而長(zhǎng)的突起，細(xì)胞核較大，呈卵圓形且多居中（圖1）。

2.2 各組A549細(xì)胞經(jīng)處理后的OD490值 從表2 可以看出：Cetuximab單藥處理組抑制率為（30.6±1.2）%；Celecoxib單藥處理組抑制率為（29.8±1.4）%；而Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯(lián)用的效果，抑制率為（61.4±2.2）%。說明兩者聯(lián)合作用具有協(xié)同效應(yīng)。

圖 1 A549細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下形態(tài)（×200）Fig 1 A549 morphology under the light microscope (×200)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布 如表3所示，Cetuximab組、Celecoxib組和Combination組G1期細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，Combination組明顯多于Cetuximab 組和Celecoxib組，而S期細(xì)胞相應(yīng)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），M期細(xì)胞無明顯變化。表明Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯(lián)用的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。

2.4 A549細(xì)胞體外侵襲力的變化 如圖2所示，對(duì)照組A549細(xì)胞穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量較多，Cetuximab組、Celecoxib組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，Combination組穿膜細(xì)胞數(shù)最少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯(lián)用能更有效地降低A549細(xì)胞的侵襲力。

表 3 對(duì)各組549細(xì)胞周期的影響（Mean±SD, n=3）Tab 3 Cetuximab and Celecoxib effect on A549 cell cycle (Mean±SD, n=3)

圖 2 不同處理組處理后A549細(xì)胞侵襲能力的影響。和對(duì)照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 2 Changes of invasion ability of A549 cells in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group,△P＜0.05.

2.5 AQP1、KDR mRNA表達(dá) 經(jīng)過相關(guān)處理后，AQP1 mRNA、KDR mRNA在Combination組表達(dá)量較Cetuximab組、Celecoxib組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.6 AQP1、KDR蛋白表達(dá) 給予相關(guān)處理后各組AQP1、KDR蛋白表達(dá)表達(dá)如下（圖4），經(jīng)過相關(guān)處理后，AQP1、KDR蛋白在Combination組表達(dá)量較Cetuximab組、Celecoxib組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖 3 各組細(xì)胞AQP1 mRNA、KDR mRNA表達(dá)變化。與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 3 Changes of AQP1 and KDR mRNA levels in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group, △P＜0.05.

圖 4 各組細(xì)胞AQP1蛋白、KDR蛋白表達(dá)變化。與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 4 Changes of AQP1 and KDR protein levels in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group, △P＜0.05.

肺癌是一種臨床常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率己占癌癥死亡率之首，可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占了到肺癌的85%以上。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。而腫瘤血管的生成在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用[9]。因?yàn)槟[瘤的持續(xù)生長(zhǎng)必須依賴新生血管生成，大量的新生血管形成是體積＞2 mm的腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)不可缺少的因素，沒有足夠的新生血管提供充足的養(yǎng)分，腫瘤的生長(zhǎng)潛能將嚴(yán)格受到限制[10,11]。

近年來的研究[12,13]表明KDR及AQP1與腫瘤血管生成關(guān)系密切，不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)KDR及AQP1，而且腫瘤細(xì)胞亦能表達(dá)。其中AQP1是腫瘤血管生成的一種新的促進(jìn)因子，被認(rèn)為是血管增生的一種標(biāo)記物。目前大量研究表明許多腫瘤組織、癌細(xì)胞系及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中AQP1呈高度表達(dá)[14,15]，并且其表達(dá)量與腫瘤惡性程度有直接關(guān)系，惡性程度越高，AQP1表達(dá)量越高[16]，提示應(yīng)用水通道蛋白（aquaporins, AQP）的抑制劑或抗AQP抗體降低AQP1的表達(dá)將會(huì)是新的治療肺腺癌手段。KDR也是腫瘤血管生成過程中主要的調(diào)控因子之一[17]。腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），除了以旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮上的KDR，促進(jìn)血管形成外，還以自分泌的方式作用于自身細(xì)胞上的KDR，直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。另外研究發(fā)現(xiàn)阻斷KDR表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，抑制KDR表達(dá)，不僅可抑制腫瘤血管生成，而且也可阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)從而阻斷肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。故以KDR為靶點(diǎn)抑制血管生成進(jìn)而控制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤治療和防止腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也有重要意義。

近年來研究[18]表明，COX-2抑制劑塞來昔布對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)分化、促進(jìn)凋亡作用；西妥昔單抗是一種腫瘤分子靶向藥物，也廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究[19,20]。本實(shí)驗(yàn)將兩者聯(lián)合應(yīng)用于A549細(xì)胞的體外培養(yǎng)，探討兩者對(duì)A549細(xì)胞KDR及AQP1表達(dá)的影響及對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞系的體外作用中，西妥昔單抗和塞來昔布都具有一定的抑瘤效應(yīng)，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，二者具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，可進(jìn)一步抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。西妥昔單抗和塞來昔布單藥作用于A549細(xì)胞能夠明顯降低AQP1和KDR基因和蛋白的表達(dá)水平，兩藥聯(lián)合時(shí)降低AQP1和KDR基因和蛋白表達(dá)的作用更加明顯。提示降低AQP1 和KDR基因和蛋白的表達(dá)可能是兩者協(xié)同作用的分子機(jī)制之一。具體機(jī)制本研究分析認(rèn)為與兩種藥物分別通過抑制COX-2及抗腫瘤作用改善微環(huán)境，進(jìn)而使AQP1和KDR基因和蛋白表達(dá)降低。西妥昔單抗和塞來昔布聯(lián)合作用后細(xì)胞凋亡率更高（P＜0.01）；聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比，可使細(xì)胞發(fā)生明顯的G1期阻滯（P＜0.01），細(xì)胞侵襲力明顯降低。本研究顯示將西妥昔單抗和塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用于肺腺癌的治療效果更佳，能夠?yàn)榕R床提供有益的思路。