賈廣成 周增強(qiáng) 侯琿 王麗 朱建蘭

蘋果輪紋病是蘋果生產(chǎn)中一種重要病害，主要危害蘋果枝干和果實(shí)，因其防治難、危害重，是目前我國蘋果生產(chǎn)的重要制約因素之一［1］。ITS基因，EF-1α基因和β-tubulin基因的 cDNA 序列已經(jīng)從多種真菌中分離并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究［2］。GUADET等將分子系統(tǒng)學(xué)方法引入鐮孢菌屬種鑒定，主要通過ITS-rDNA、EF-1α、β-tubulin 等手段對(duì)鐮孢菌進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)研究。微管是真核生物中普遍存在的結(jié)構(gòu)，與微絲和中間纖維一起組成細(xì)胞質(zhì)中三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的骨架系統(tǒng)。微管的組成為微管蛋白，主要的兩種微管蛋白為A和B微管蛋白，A微管蛋白和B微管蛋白形成微管裝配的基本單位-微管蛋白異二聚體。1963年，Ledbetter和Porter最先報(bào)道在植物細(xì)胞中存在微管結(jié)構(gòu)。在植物病菌中，報(bào)道了若干 ITS基因，EF-1α基因和β-tubulin基因［3，4］的相關(guān)序列，但對(duì)其生物學(xué)功能還未進(jìn)行深入研究［5］。微管蛋白和轉(zhuǎn)錄因子是真菌基因組主要的基因，在病菌的侵染過程中具有非常重要的作用。開展微管蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的研究將為闡明蘋果輪紋病菌在侵染過程中的致病機(jī)理提供理論依據(jù)［6］。為了鑒定蘋果輪紋病菌并明確其主要致病基因的存在狀況，從有代表性的蘋果種植區(qū)采集并分離10個(gè)蘋果輪紋病菌菌株，對(duì)引起蘋果輪紋病的病原進(jìn)行鑒定，并對(duì)病原的主要致病基因的存在狀況進(jìn)行初步研究，旨在達(dá)到聯(lián)合鑒定蘋果輪紋病菌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

從河南、遼寧和山東蘋果種植區(qū)選擇10株菌株。這些菌株采集于發(fā)病的枝干和果實(shí)，后經(jīng)單孢或單菌絲分離得到，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 致病力測定 接種材料為富士蘋果一年生枝條，接種地點(diǎn)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所南園。用 70％乙醇對(duì)接種區(qū)域表皮進(jìn)行消毒，待乙醇揮發(fā)后取菌餅接于樹皮光滑部位，接后用沾有無菌水的脫脂棉浸縛在菌餅上，隨后立即纏上塑料條保濕。致病力測定試驗(yàn)設(shè)3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)內(nèi)每個(gè)菌株接種1棵蘋果苗，每棵苗接種3個(gè)枝，每個(gè)枝上接3個(gè)點(diǎn)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)兩次。致病力測定的接種時(shí)間為2012年6月20日，調(diào)查時(shí)間為2012年11月10日，調(diào)查每個(gè)接種點(diǎn)的瘤狀凸起的發(fā)生情況，并記錄發(fā)病等級(jí)，最后計(jì)算病情指數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下表1所示。

表1 病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 菌體準(zhǔn)備 將菌種接種于PSA斜面培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)3d，挑菌于100mL液體培養(yǎng)基中，在220r/min的搖床上于26℃培養(yǎng)3-4d，離心收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌菌絲3次，保存于-20℃冰箱。

1.2.3 DNA提取 用無菌竹簽挑取菌絲體1g加入研缽中，并加入預(yù)先準(zhǔn)備好的液氮，研磨至菌落分散至單個(gè)細(xì)胞，即無成團(tuán)菌絲體存在。將研磨液吸入1.5mL的滅菌EP管中，加入100μL預(yù)熱至35℃的裂解液，并且震蕩搖勻5s，加入400μL的65℃預(yù)熱的抽提液，倒置震蕩5s。加入600μL的Tris飽和酚氯仿抽提液，混勻5s，12000r/min離心5min。取離心后的上清液入另一只滅過菌的EP管中，加入等體積的異丙醇離心沉淀。用70％的乙醇再洗滌一次，離心后倒出乙醇，風(fēng)干EP管，至無酒精氣味后，加入30μL TE溶液（pH8.0）溶解，各菌種DNA樣品取出2μL用于0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，用120 V電壓電泳30min后，在320nm紫外燈下觀測。最后存于-20℃的冰箱中備用。

1.2.4 基因擴(kuò)增［7］采用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增rDNA ITS1+5.8+ITS2片段。采用引物728F和986R擴(kuò)增EF-1α基因片段。采用引物Bt2a和Bt2b擴(kuò)增β-tubulin基因片段。

引物 ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATAT-3'。

引物 728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'，986R：5'-ACTTG-AAGGAACCCTTACC-3'。

引物 Bt2a：5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'，Bt2b：5'-ACCCTCCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。

PCR 反應(yīng)體系為50μL：ddH2O 33.5μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP（2.5mmol/L）5μL，Taq 酶（5U/μL）0.5μL，引物11μL，引物21μL，模板4μL（50ng/μL）。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 2min；94℃變性 30s，55℃退火30s，72℃延伸 40s，共35個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖電泳檢測后，由上海生工進(jìn)行雙向測序，拼接好的序列用于序列分析。

1.2.5 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測得序列用Sequencing Analysis 5.2（Applied Biosystems）軟件反復(fù)進(jìn)行校對(duì)，去除兩端不確定的序列后，在 GenBank中進(jìn)行 BLASTn比較搜索，下載同源性序列；同時(shí)下載 GenBank 中Botryosphaeria 的ITS基因、EF-1α基因和β-tubulin基因序列進(jìn)行分析。運(yùn)用 MEGA5分別計(jì)算不同種及亞種之間的遺傳距離（p-distance）和堿基差異數(shù)目，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［2］。

2 結(jié)果

2.1 蘋果輪紋病菌株情況蘋果輪紋病菌株情況如表2所示。

2.2 序列相似度比較

將PCR 產(chǎn)物電泳后于紫外透射下觀察，分別在約540bp、440bp與250bp出現(xiàn)一條清晰的cDNA條帶。DNAMAN軟件分析將所測得的ITS基因、β-tubulin基因和EF-1α基因序列通過查詢NCBI網(wǎng)站，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。

病原菌的rDNA-ITS序列測定結(jié)果菌株經(jīng)過測序后獲得約540bp的DNA序列，GenBank 檢索結(jié)果（表3）表明，HX11，PY19和ZZ42菌株ITS序列與Botryosphaeria dothidea的同源性達(dá)到100％，其它菌株同源性均為99％。

病原菌的β-tubulin基因序列經(jīng)過測序后獲得約450bp的DNA片段，GenBank 檢索結(jié)果（表4）表明，全部菌株β-tubulin基因序列與Botryosphaeria dothidea的同源性達(dá)到99％。

病原菌的EF-1α基因序列測定結(jié)果菌株經(jīng)過測序后獲得約250bp的DNA序列，GenBank 檢索結(jié)果（表5）表明，HL1、PY19、YC5、YT1和ZZ42菌株EF-1α基因序列與Botryosphaeria dothidea的同源性達(dá)到100％，HX11和YC6菌株菌株 EF-1α基因序列與Botryosphaeria dothidea的同源性達(dá)到99％，其它菌株同源性均為98％。

表2 蘋果輪紋病菌株在田間的病情指數(shù)

表3 蘋果輪紋病菌株ITS基因序列與GenBank中ITS基因序列相似度比較

表4 蘋果輪紋病菌株β-tubulin基因序列與GenBank中β-tubulin基因序列相似度比較

表5 蘋果輪紋病菌株EF-1α基因序列與GenBank中EF-1α基因序列相似度比較

2.3 菌種的的系統(tǒng)進(jìn)化分析［8］

各菌種ITS基因、EF-1α基因和β-tubulin基因序列間的遺傳相似性極大，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹上各分枝上的數(shù)值為經(jīng)1000次Bootstrap后的置信度。初步探討了各菌種間的遺傳關(guān)系。

根據(jù)10個(gè)供試蘋果輪紋病菌的ITS基因序列和從NCBI上下載的4個(gè)其它菌株，利用DNAMAN軟件比對(duì)后經(jīng)MEGA5.0軟件分析構(gòu)建上述物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）可以看出，比對(duì)為Botryosphaeria dothidea的10個(gè)供試蘋果輪紋病菌與同屬的 Botryosphaeria corticis、Botryosphaeria sp、Botryosphaeriamamane和Botryosphaeria iberica可以明顯的區(qū)分。系統(tǒng)進(jìn)化樹與NCBI中比對(duì)的結(jié)果一致，表明了試驗(yàn)結(jié)果的可信性，可以確定蘋果輪紋病菌的病原菌為Botryosphaeria dothidea。

10個(gè)供試蘋果輪紋病菌的β-tubulin基因序列和從NCBI上下載的3個(gè)其它菌株，利用DNAMAN軟件比對(duì)后經(jīng)MEGA5.0軟件分析構(gòu)建上述物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由系統(tǒng)樹（圖2）可見，所有菌株可分成兩大支，其中一支為HL1、YC6、SS2、LY20、PY19、YC5、ZZ42， 另 一 支 為 SS1、YT1、HX11、JN607129、JQ659299，DQ008335， 這 兩 支之間的親緣關(guān)系也很近。但在SS1、YT1、HX11、JN607129、JQ659299，DQ008335 這支中 SS1、YT1、HX11 和 Botryosphaeria rhodina、Botryosphaeria sp，Botryosphaeria corticis也是有發(fā)育上的分化。

圖1 蘋果輪紋病菌ITS基因堿基序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 蘋果輪紋病菌β-tubulin基因堿基序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)10個(gè)供試蘋果輪紋病菌的EF-1α基因序列和從NCBI上下載的3個(gè)其它菌株，利用DNAMAN軟件比對(duì)后經(jīng)MEGA5.0軟件分析構(gòu)建上述物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）可以看出，比對(duì)為Botryosphaeria dothidea的10個(gè)供試蘋果輪紋病菌與同屬的 Botryosphaeria corticis、Botryosphaeria sp、Botryosphaeriamamane和Botryosphaeria iberica無法區(qū) 分。SS1、SS2和 HX11與 Botryosphaeriamamane的親緣關(guān)系更近。

圖3 蘋果輪紋病菌EF-1α基因堿基序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

PCR技術(shù)是模擬自然界DNA復(fù)制過程，從而快速準(zhǔn)確得到更多DNA樣本［9］。基因檢測是用于DNA序列的測定，基因表達(dá)譜鑒定和基因突變體的檢測和分析［10］。本研究中使用了DNAMAN和MEGA兩種軟件對(duì)蘋果輪紋病菌的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，并且得到了相似的結(jié)果，說明以上兩種軟件均可使用。

隨著微管的發(fā)現(xiàn)，其諸多重要的生物學(xué)功能也被發(fā)現(xiàn)［11］。研究表明，微管與維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞壁構(gòu)建等植物重要的生理活動(dòng)有著密切的聯(lián)系［12］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種真核生物中的微管蛋白基因被擴(kuò)增出來，微管已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。微管蛋白基因核酸及氨基酸序列的比較分析研究表明，微管蛋白是生物進(jìn)化中最為保守的蛋白質(zhì)之一。植物中的微管蛋白高度保守。在植物細(xì)胞中引入不同植物物種的微管蛋白，外源微管蛋白可以被組合進(jìn)入植物微管列陣，卻不影響其功能［13］。本研究克隆得到的10條β-tubulin基因序列和Botryosphaeria dothidea中的高相似性，同樣證明了蘋果輪紋病菌中B微管蛋白的高度保守性。目前，基于β-tubulin基因在真核生物中廣泛存在的特點(diǎn)，以及β-tubulin基因的植物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究已取得的成績，β-tubulin基因?qū)⒃谔O果輪紋病菌的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系研究中具有十分重要的意義。在進(jìn)行有關(guān)核酸序列分析的時(shí)候，最好同時(shí)用不同的軟件進(jìn)行分析，可以做到相互印證所分析的結(jié)果。

延伸因子EF-1α基因是一種編碼蛋白質(zhì)的單拷貝核基因，在t RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體的過程中發(fā)揮作用，在研究系統(tǒng)發(fā)育方面具有重要作用，同時(shí)，EF-1α基因中也存在一些進(jìn)化速度比較快的內(nèi)元，因此它也可以分析低級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育，許多學(xué)者對(duì)其在分子系統(tǒng)學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)做了大量的嘗試。Caterino等（2000）主張將 EF-1α基因作為分子系統(tǒng)學(xué)研究中的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記［14］。

4 結(jié)論

蘋果輪紋病菌的ITS基因序列相似性很高，蘋果輪紋病的病原菌是Botryosphaeria dothidea。證明了EF-1α基因和β-tubulin基因分化趨勢，這與測得的蘋果輪紋病菌田間致病力的分化相對(duì)應(yīng)。EF-1α基因和β-tubulin基因與菌株的致病力有相關(guān)性，但EF-1α基因和β-tubulin基因復(fù)雜的分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

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