郭松林 王玉 關(guān)瑞章 馮建軍 林鵬 楊求華

鰻鱺疾病按病原可分為細(xì)菌性、真菌性、寄生蟲性、病毒性及其他類型病原五大類，其中細(xì)菌性疾病危害十分嚴(yán)重，其導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失占疾病總損失的90％以上。已發(fā)現(xiàn)的歐洲鰻鱺細(xì)菌性病原有十幾種，包括氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、威隆氣單胞菌（也稱維氏氣單胞菌，A.veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）和獸生氣單胞菌（A.bestiarum），愛德華氏菌屬的遲頓愛德華氏菌以及弧菌屬的致傷弧菌、鰻弧菌和非01群霍亂弧菌［1-4］。在我們課題組近10年建立的87株鰻鱺病原菌菌種庫中，有約80％為病原性氣單胞菌。由于氣單胞菌血清型復(fù)雜［5］，且具有地緣性與種間特異性［6］，故研制的滅活疫苗難以在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用［7］。解決此問題的途經(jīng)之一是尋找病原菌間的共同保護(hù)性抗原基因片段，以制備預(yù)防同種或同屬但血清型不同病原菌所致疾病的基因工程疫苗［8］。革蘭氏陰性病原菌表面的外膜蛋白（Outermembrane proteins，OMP）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有成分，除了在維持菌體外膜結(jié)構(gòu)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用外，還是一種重要的保護(hù)性抗原，能有效激發(fā)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫，在宿主體內(nèi)具有良好的免疫原性［9］。同時(shí)，某些OMP在多種病原菌間存在高度保守性，可對同屬不同種或同種不同血清型菌株的感染產(chǎn)生交叉保護(hù)，從而成為亞單位疫苗最具潛力的抗原候選成分之一［10-12］。

本研究擬采用已分離到的30株鰻鱺病原性氣單胞菌為材料，使用NCBI/GenBank 數(shù)據(jù)庫檢索獲得多個(gè)氣單胞菌的外膜蛋白基因序列，經(jīng)比對分析后，從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞胞菌（A.salmonicida）全基因組中釣出特定外膜蛋白的基因全長及該基因以外兩端的序列，據(jù)這兩端序列在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞胞菌中的保守性設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增30株病原性氣單胞菌的外膜蛋白基因并對其推導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，從而為鰻鱺外膜蛋白共同保護(hù)性抗原基因工程疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)儀器主要包括高速冷凍離心機(jī)（Sigma），臺(tái)式離心機(jī)H1650-W（湖南湘儀），PCR儀（東勝創(chuàng)新），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一），生化培養(yǎng)箱（SHP-250）和微波爐（DJ21F-B）等。主要試劑為 Taq 酶（5U/μL），dNTP（2.5mmol/L），10×loading buffer，引物和DNA Marker購自上海捷瑞生物工程有限公司，溴化乙錠（EB）購自百維信公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自BioTeke公司。

30株鰻鱺病原性氣單胞菌由鰻鱺工程研究中心病原菌菌種庫提供，經(jīng)Biolog自動(dòng)菌鑒系統(tǒng)（含96個(gè)生化指標(biāo)）分別鑒定到種或?qū)?。其中嗜水氣單胞?株；威隆氣單胞菌16株；豚鼠氣單胞菌3株；簡達(dá)氣單胞菌1株；另1株僅鑒定為氣單胞菌屬（表 1）。

表1 30株病原性氣單胞菌的鑒定結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與DNA模板的制備 30株病原菌接種于胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基（TSB），28℃培養(yǎng)24h。采用BioTeke公司的試劑盒（離心柱型）提取，提取方法參考試劑盒內(nèi)的說明書。提取的DNA經(jīng)1 ％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，紫外分光光度計(jì)測DNA含量，調(diào)DNA含量為50ng/μL，備用。

1.2.2 病原性氣單胞菌外膜蛋白基因序列的檢索、篩選與比對 利用核酸序列數(shù)據(jù)庫NCBI/GenBank，以關(guān)鍵詞 “outerme-mbrane protein” ＆“Aeromonas”進(jìn)行檢索。下載包括基因登錄號，基因序列，病原菌來源等外膜蛋白序列的主要信息，建立氣單胞菌外膜蛋白（Aeromonas ＆ outermembrane protein）基因資料庫。選取資料庫中17株700bp以上的外膜蛋白基因序列（GenBank序列登錄號：HQ331525.1，HM-114316.1，GU134620.1，AF146597.2，F(xiàn)J437031.1，F(xiàn)J-437030.1，GU196148.1，DQ008470.1，AY442271.1，AY378290.1，AF276639.2，F(xiàn)J208990.1，EU309491.1，DQ177328.1，AB290200.1，F(xiàn)J711769.1，AF183931.1），經(jīng)Clustal X1.83比對分析后，采用Mega4.0軟件構(gòu)建17條序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 參考17條序列的基因比對結(jié)果，采用其中4條外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因序列（AF183931.1，AF276639.2，F(xiàn)J437031.1，F(xiàn)J437030.1）的高度保守區(qū)域（ccgaccgatatcttcaacgagtg），從嗜水氣單胞菌（登錄號：CP000462）和殺鮭氣單胞菌（登錄號：CP000644）基因組全長序列中釣出該蛋白的基因全長及該基因外上游與下游的兩端序列。根據(jù)兩端序列在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的保守性，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)增30株病原性氣單胞菌的Ⅱ型孔蛋白（約1250bp）。上游引物F：5' CTTCGCTGACACAGGGAATAAC 3'，下游引物 R：5' AGACAACGTGAACTGGCG 3'。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL）：10×PCR Buffer 5μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，引物（10μmol/L）各 0.2μL，Taq 酶（5U/μL）0.4μL，DNA 模 板 2μL， 補(bǔ)無菌水至50μL。反應(yīng)條件：94℃變性5min，94℃1min，51℃ 1min，72℃ 2min，33 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 l0min，4℃ 保存。

1.2.4 擴(kuò)增基因的測序與比對分析 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％ 瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照記錄擴(kuò)增效果。將擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收后送至Invitrogen公司直接測序，然后用ClustalX1.83比對分析后，采用Mega4.0軟件構(gòu)建測序結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 氨基酸序列的比對分析 將擴(kuò)增到的10株氣單胞菌基因和網(wǎng)上已經(jīng)遞交的2個(gè)Ⅱ型孔蛋白全長序列翻譯為氨基酸序列后，用ClustalX1.83進(jìn)行多重比對并列表分析Ⅱ型孔蛋白氨基酸序列的相似性。1.2.6 推導(dǎo)Ⅱ型孔蛋白的結(jié)構(gòu)、親水性與抗原決空簇分析 據(jù)擴(kuò)增得到的10株氣單胞菌的外膜蛋白全長序列，選取其中一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白DNA全長序列，轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后，用SOPMA程序（http：//www.expasy.ch/tools/）和 SOSUI 法［14］（http：//bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html）分別對推導(dǎo)蛋白進(jìn)行二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；以DNAstar軟件的Editseq和Protean程序分別對該蛋白質(zhì)分別進(jìn)行親水性與免疫原性分析［13］，通過BioEdit和Clustalx軟件分別對10個(gè)氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白DNA全長序列進(jìn)行抗原決定簇及其保守性比對分析。

2 結(jié)果

2.1 氣單胞菌外膜蛋白參考序列的系統(tǒng)發(fā)育

從17條氣單胞菌外膜蛋白基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知，在黑箭頭處遺傳距離標(biāo)尺約0.13時(shí)，這些序列可分為8個(gè)分支，第一個(gè)分支有6條序列，其中2條為主要外膜蛋白（DQ008470.1，F(xiàn)J20899-0.1），3條為推測外膜蛋白（AY442271.1，AF1465-97.2，EU309491.1），1條為外膜蛋白A前體（GU-196148.1）；第2個(gè)分支為2條I型外膜蛋白序列（AB290200.1、FJ711769.1）；第 3個(gè)分支為 4條Ⅱ型孔蛋白序列（AF183931.1，AF276639.2，F(xiàn)J4370-31.1，F(xiàn)J437030.1）。其余5條序列各為1個(gè)分支，分別為主要外膜蛋白（DQ008470.1），外膜蛋白前體N（AY378290.1），外膜蛋白（GU134620.1），外膜蛋白W（HM114316.1）和類似外膜蛋白（HQ331525.1）（圖1）。由于前3個(gè)分支只有4個(gè)Ⅱ型孔蛋白序列有一個(gè)高度保守的片段（ccgaccgatatcttcaacgagtg），故使用這個(gè)外膜蛋白進(jìn)行鰻鱺病原性氣單胞菌的外膜蛋白擴(kuò)增。

圖1 17個(gè)氣單胞菌已知外膜蛋白基因片段的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因全長的PCR擴(kuò)增

通過PCR擴(kuò)增30株病原性氣單胞菌的Ⅱ型孔蛋白基因，經(jīng)瓊脂糖電泳結(jié)果（圖2）顯示，有11株 菌（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B60-1、B65）都得到了較單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增出的基因分子量在1200bp左右，與預(yù)期目的條帶大小一致，除一株菌（B60-1）外，其余10株菌均測出Ⅱ型孔蛋白的全長序列。

圖2 30株氣單胞菌外膜蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

10 個(gè)（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因全長序列的開放閱讀框在1038bp到1 125bp之間。這10個(gè)菌株包括2株威隆氣單胞菌（B53、B53-1）和1株豚鼠氣單胞菌（B14），其余7株為嗜水氣單胞菌（表1）。將10條序列與1條已知Ⅱ型孔蛋白（AF-183931.1）和2條分別從嗜水氣單胞菌（登錄號：CP000462）和殺鮭氣單胞菌（登錄號：CP000644）基因組全長釣出的Ⅱ型孔蛋白序列（seqAh-omp II和seqAs-omp II）進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖3）表明，除1株豚鼠氣單胞菌（B14）外，其余12個(gè)Ⅱ型孔蛋白基因均具有較高的同源性。Mega4.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，該基因在菌株間的遺傳距離在0.000-0.358之間，平均為0.179，其中菌株B11與其余菌株在該序列的平均遺傳距離為0.187，接近平均遺傳距離。因此，本研究以該序列的理論表達(dá)產(chǎn)物為代表進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與抗原決定簇分析，從而為該基因的進(jìn)一步表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性及交叉保護(hù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

圖3 13個(gè)病原性氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白基因全長的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 B11菌株Ⅱ型孔蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能

2.4.1 二級與三級結(jié)構(gòu)分析 采用SOPMA 程序?qū)11菌株OMPⅡ的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析。結(jié)果表明，該基因共編碼 362個(gè)氨基酸，其中有78個(gè)堿性氨基酸（28個(gè)賴氨酸K，9個(gè)精氨酸R，41個(gè)組氨酸H）和52個(gè)酸性氨基酸（36個(gè)天冬氨酸D，16個(gè)谷氨酸E）；132個(gè)非極性疏水氨基酸（39個(gè)丙氨酸A，14個(gè)異亮氨酸I，24個(gè)亮氨酸L，23個(gè)苯丙氨酸F，7個(gè)色氨酸W，25個(gè)纈氨酸V）和163個(gè)極性中性氨基酸（23個(gè)天冬酰胺N，1個(gè)半胱氨酸C，14個(gè)谷氨酰胺Q，26個(gè)絲氨酸，27個(gè)蘇氨酸T，26個(gè)酪氨酸Y，42個(gè)甘氨酸G，4個(gè)蛋氨酸M）；3個(gè)脯氨酸P，1個(gè)任意氨基酸X。利用SOPMA 程序預(yù)測的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4）顯示，此外膜蛋白可形成螺旋（Helix）、片層（Sheet）、轉(zhuǎn)角（Turn）和卷曲（Coil）等結(jié)構(gòu)；其中α螺旋（Alphahelix Ah）比例約27.81％；未形成β螺旋和γ螺旋；舒展性螺旋（Extended strand Ee）比例約25.00％；β轉(zhuǎn)角（Beta turn Tt）比例約3.57％；無規(guī)則卷曲（Random coil Cc）比例約43.62％；其他結(jié)構(gòu)域?yàn)? 。

圖4 SOPMA法預(yù)測Ⅱ型孔蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

SOSUI 法預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，外膜蛋白氨基酸序列存在信號肽區(qū)和跨膜螺旋區(qū)，其中前者由4個(gè)氨基酸組成，后者由23個(gè)氨基酸組成，其余335個(gè)氨基酸均為該外膜蛋白細(xì)胞膜外的氨基酸序列，這些膜外序列常認(rèn)為是可刺激宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的保護(hù)性抗原。

圖5 SOSUI 法預(yù)測Ⅱ型孔蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

2.4.2 親水性分析 DNAstar軟件Protean TM程序的Plot-Kyte-Doolittle 法預(yù)測結(jié)果（圖6）顯示，此外膜蛋白有大約90％以上的區(qū)域處于正高分值（縱坐標(biāo)正值越大，親水性越強(qiáng)），表明該蛋白具有良好的親水性，屬親水性蛋白，此結(jié)果為該基因所表達(dá)蛋白質(zhì)的純化提供了有價(jià)值的參考。

圖6 Ⅱ型孔蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的的親水性分析

2.4.3 抗原決定簇分析 采用DNASTAR軟件Lasergene程序ProteanTM模塊中的Jomeson-Wolf 法預(yù)測分析Ⅱ型孔蛋白的免疫原性，結(jié)果（圖7）表明此外膜蛋白大約85％抗原峰值大于臨界值0，處于正分處（縱坐標(biāo)正值越大，免疫原性越強(qiáng)）。根據(jù)主要的抗原峰推測該蛋白有15個(gè)抗原決定簇，其在蛋白質(zhì)上的氨基酸順序分別位于24-32、43-53、84-92、94-101、103-112、120-127、157-163、181-187、194-201、237-248、266-274、275-285、307-312、314-322和346-355，指示該蛋白理論上具有良好的免疫原性。

圖7 Ⅱ型孔蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性分析

2.5 Ⅱ型孔蛋白基因推導(dǎo)氨基酸序列的比對與共同抗原決定簇分析

通 過 BioEdit和 Clustal X軟 件 對 9個(gè)（B11、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因和3個(gè)參考基因（AF183931.1，seqAh-omp II和seqAs-omp II）的氨基酸序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)孔蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性。將這些同源序列與B11菌株的抗原決定簇分析結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)存在于12株菌中的保守抗原決定簇（圖8，下劃線部分）。這6個(gè)抗原決定簇在B11中的氨基酸序列分別為第24-32（YDKDGTTFD），120-127（DGSQYGKI），157-163：（DGRQEGQ），181-187（TNDDQAV），275-285（GYKDKGRGYEL）和 346-355（MDNKDDEWTV）。6個(gè)保守抗原決定簇仍然存在少許的差異：第一個(gè)決定簇的第7個(gè)氨基酸在B53和B53-1中為S，而在其它菌株中為T；第2個(gè)決定簇的第2個(gè)氨基酸在seqAs-ompII和B11中為S，而在其它菌株中為T，第7個(gè)氨基酸在AF183931.1中為V，其他菌株中為I；第3個(gè)決定簇的第2個(gè)氨基酸在seqAs-ompII中為S，其它菌株中為G；第4個(gè)決定簇的第4個(gè)氨基酸在B48和B65中為N，其它菌株中為D，但在第5個(gè)氨基酸處區(qū)別稍大，4個(gè)K，3個(gè)Q，E和V各兩個(gè)，1個(gè)T，第7個(gè)氨基酸在seqAs-ompII中為E，其它菌株中為V；第5個(gè)決定簇的第2個(gè)氨基酸區(qū)別稍大，有5個(gè)Y，4個(gè)D，2個(gè)N和1個(gè)R，第4個(gè)氨基酸在B48和B65中為G，其它菌株中為D；第6個(gè)決定簇的第3個(gè)氨基酸在seqAs-ompII、AF183931.1和B20中為D，其它菌株中為E；第4個(gè)氨基酸在B20、AF183931.1、B53和B53-1中為F，而在其他菌株中為W。

3 討論

近年的大量研究發(fā)現(xiàn)，魚類病原菌的外膜蛋白（OMP）是疫苗研制的重要保護(hù)性抗原［12，13］。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，越來越多的病原菌OMP基因測序得以完成。根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫已知OMP的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，然后從魚類病原菌庫的基因組中擴(kuò)增目標(biāo)基因，再利用合適的載體進(jìn)行重組表達(dá)，大大加快了疫苗抗原篩選的速度。這些重組OMP保持了天然OMP的免疫原性和免疫保護(hù)作用，均能有效刺激魚體產(chǎn)生特異性抗體［8］，某些OMP還能顯著增強(qiáng)機(jī)體吞噬細(xì)胞的吞噬活性［15］，并能對相應(yīng)病原菌的攻毒感染提供50％-100％不等的免疫保護(hù)率。隨著研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)某些OMP為不同病原菌或同種病原菌不同血清型的共同保護(hù)性抗原，免疫后可對多種病原菌的交叉感染提供免疫保護(hù)作用。Kawai等［16］分別從3株不同血清型的遲鈍愛德華氏菌中，利用十二烷基肌氨酸鈉抽提、超速離心、免疫印跡、雙向電泳等方法均分離純化到分子量大小約為37kD的OMP。該蛋白免疫日本牙鲆后，對3株病原菌的感染分別提供50％、65.5％和70％的交叉免疫保護(hù)作用。Fang等獲得分子量為43kD 的重組OMP，并利用氨基酸序列同源性分析、Western blot 免疫印跡等方法證明該OMP是9株嗜水氣單胞菌和1株溫和氣單胞菌的共同OMP抗原。該重組OMP免疫藍(lán)絲鱸后，能夠針對其中2株相同血清型和1株不同血清型嗜水氣單胞菌的感染提供分別為87.5％、75％和44.4 ％的交叉免疫保護(hù)率［17］。同時(shí)，也可利用融合PCR 技術(shù)將多種共同或主要抗原基因進(jìn)行融合表達(dá)，以進(jìn)一步構(gòu)建多價(jià)重組外膜蛋白疫苗，從而進(jìn)一步擴(kuò)大對病原菌的交叉保護(hù)范圍［18］。

圖8 12個(gè)Ⅱ型孔蛋白基因推導(dǎo)的氨基酸序列的比對

本研究利用核酸序列數(shù)據(jù)庫NCBI/GenBank，找到氣單胞菌屬的17外膜蛋白基因序列并進(jìn)行比對，采用相關(guān)軟件構(gòu)建這些序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；并通過一定的遺傳距離將其分為8個(gè)分支，若分支中含有多個(gè)序列，則根據(jù)其保守區(qū)域從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組全長序列（登錄號分別為CP000462和CP000644）中搜索該基因在基因組中的位置并在該基因之外的上下游約100bp的兩端設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)增出該基因序列的全長。本試驗(yàn)根據(jù)圖1的第1、2和4等3個(gè)分支分別找到了3個(gè)基因在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組全長序列中的位置，并按上述方法分別設(shè)計(jì)了3對引物，以30株病原性氣單胞菌的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4個(gè)分支的II型孔蛋白基因能擴(kuò)增到11個(gè)目的基因并測出了其中10個(gè)基因的全長序列，其余兩支僅分別能擴(kuò)增到4株和0株菌的基因（數(shù)據(jù)未在本論文提供），表明II型孔蛋白可能是存在于鰻鱺源病原性氣單胞菌的主要外膜蛋白［5］。

擴(kuò)增10株菌的OMP基因序列與3個(gè)參考序列比對分析后顯示，B11菌株的OMP基因序列與其它菌株的序列平均遺傳距離居中，有可能成為這些菌株間的交叉保護(hù)抗原。此外，B11菌株毒性較強(qiáng)，其對歐洲鰻鱺的半數(shù)致死量約為105CFU/g體重［19］，且具有良好的研究背景［5，20-21］。采用該基因約500bp的序列片段構(gòu)建重組表達(dá)載體，其表達(dá)的30kD外膜蛋白經(jīng)皮下注射免疫歐洲鰻鱺后，對嗜水氣單胞菌（B11）和溫和氣單胞菌的攻素毒感染能分別提供50％和70％的相對保護(hù)率［12］。免疫原性分析表明，該表達(dá)產(chǎn)物有15個(gè)抗原決定簇，其中14個(gè)決定簇位于該蛋白的細(xì)胞膜外區(qū)域，有望在病原性氣單胞菌間產(chǎn)生廣泛的交叉免疫保護(hù)作用［18，22］。因此，本研究采用的免疫原性分析軟件對II型孔蛋白基表達(dá)產(chǎn)物的理論分析具有較好的預(yù)測能力。另外，對12個(gè)基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對分析后，發(fā)現(xiàn)存在于多株鰻鱺病原性氣單胞菌間的6個(gè)較為保守的抗原決定簇，提示該基因表達(dá)的OMP很可能對多株病原菌的感染產(chǎn)生交叉保護(hù)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

B11菌株擴(kuò)增基因推導(dǎo)OMP的二級結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白有362個(gè)氨基酸，能形成的螺旋（Helix）、片層（Sheet）、轉(zhuǎn)角（Turn）和卷曲（Coil）等結(jié)構(gòu)，提示其具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)；三級結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白具有信號肽、跨膜區(qū)和膜外區(qū)域，而膜外蛋白區(qū)域通常直接暴露于魚類的免疫系統(tǒng)，易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)［8，12］。因此，二級與三級結(jié)構(gòu)分析為該蛋白的免疫原性研究奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)［23］。此外，該OMP的親水性分析表明其親水性較高，此結(jié)果為該表達(dá)蛋白的進(jìn)一步純化提供了有價(jià)值的參考［24］。值得一提的是，本研究材料中的30個(gè)菌株包含4種細(xì)菌，從1株豚鼠氣單胞菌（B14）擴(kuò)增到的該基因與其他9個(gè)基因同源性很低，未從簡達(dá)氣單胞菌（B29）中擴(kuò)增到該外膜蛋白基因，因此，B11菌株表達(dá)的OMP對這兩個(gè)菌種的免疫交叉保護(hù)也有待于研究證實(shí)。然而，我們的研究表明，嗜水氣單胞菌和威隆氣單胞菌為近10年從養(yǎng)殖的發(fā)病鰻鱺分離的主要菌株［21，25］，以本研究為基礎(chǔ)研制的外膜蛋白共同保護(hù)性疫苗將具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

比對17個(gè)氣單胞菌己知外膜蛋白基因序列，獲得其中一種外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因的保守片段，通過該片段從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組中釣出該基因全長。據(jù)該基因以外兩端的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以30株鰻鱺病原性氣單胞菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增并獲得10株菌的Ⅱ型孔蛋白基因全長。經(jīng)遺傳距離分析后選擇一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有三級結(jié)構(gòu)，親水性強(qiáng)且有15個(gè)抗原決定簇，其中6個(gè)為存在于9株鰻鱺病原菌間的保守抗原決定簇。

［1］ 艾紅, 李永振.養(yǎng)殖鰻鱺的主要疾病與防治研究現(xiàn)狀［J］.湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 18（4）：71-76

［2］ 郭松林.鰻鱺細(xì)菌性疾病的研究概況［J］.科學(xué)養(yǎng)魚, 2011, 7：48-49.

［3］ Esteve-Gassent MD, Fouz B, Barrera R, et al.Efficacy of oral reimmunisation after immersion vaccination against Vibrio vulnificus in farmed European eels［J］.Aquaculture, 2004, 231：9-22.

［4］ 殷戰(zhàn), 徐伯亥.魚類細(xì)菌性疾病的研究［J］.水生生物學(xué)報(bào),1995, 19（1）：76-83.

［5］ 郭松林.鰻鱺病原菌的分類鑒定及相關(guān)免疫基礎(chǔ)研究［D］.武漢：中國科學(xué)院水生生物研究所, 2006：106-125.

［6］ 樊海平, 吳斌, 曾占壯, 等.日本鰻鱺體表潰瘍病病原菌的分離鑒定及單克隆抗體制備［J］.中國水產(chǎn)科學(xué), 2009, 16（2）：295-302.

［7］ Esteve-Gassent MD, Fouz B, Amaro C.Efficacy of a bivalent vaccine against eel diseases caused by Vibrio vulnificus after its administration by four different routes［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology, 2004,16：93-105.

［8］ Mao Z, Yu L, You Z, et al.Cloning, expression and immunogenicity analysis of five outermembrane proteins of Vibrio parahaemolyticus zj2003［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology, 2007, 23：567-575.

［9］ 熊靜, 關(guān)瑞章, 郭松林, 等.魚類病原菌外膜蛋白及其免疫原性研究進(jìn)展［J］.水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35（1）：163-169.

［10］ Lutwyche P, Exner MM, Hancok RE.Conserved Aeromonas salmonicida porin provides protective immunity to rainbow trout［J］.Infection and Immunity, 1995, 63（8）：3137-3142.

［11］ Rarahman MH, Kawai K.Outermembrane proteins of Aeromonashydrophila induce protective immunity in goldfish［J］.Fish ＆Shellfish Immunology, 2000, 10（4）：379-382.

［12］ Guan RZ, Xiong J, Huang WS, et al.Enhancement of protective immunity in European eel（Anguilla anguilla）against Aeromonashydrophila and Aeromonas sobria by a recombinant Aeromonas outermembrane protein［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2011, 43（1）：79-88.

［13］ 熊靜.鰻鱺病原菌共同外膜蛋白基因片段的篩選及其重組表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性研究［D］.武漢：中國科學(xué)院水生生物研究所, 2009：23-64.

［14］ Mitaku S, Hirokawa T, Tsuji T.Amphiphilicity index of polar amino acids as an aid in the characterization of amino acid preference atmembrane-water interfaces［J］.Bioinformatics, 2002, 18：608-616.

［15］ Zhang C, Yu L, Qian R.Characterization of OmpK, GAPDH and their fusion OmpK-GAPDH derived from Vibrioharveyi outermembrane proteins：their immunoprotective ability against vibriosis in large yellow croaker（Pseudosciaena crocea）［J］.Journal of Applied Microbiology, 2007, 103：1587-1599.

［16］ Kawai K, Liu Y, Ohnishi K, et al.A conserved 37kDa outermembrane protein of Edwardsiella tarda is an effective vaccine candidate［J］.Vaccine, 2004, 22：3411-3418.

［17］ Fang HM, Ge R, Sin YM.Cloning, characterization and expression of Aeromonashydrophilamajor adhesion［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology, 2004, 16：645-658.

［18］ 王玉.鰻鱺病原性氣單胞菌與愛德華氏菌外膜蛋白基因工程二聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化與免疫原性初步研究［D］.廈門：集美大學(xué), 2012：14-80.

［19］ 郭松林, 馮建軍, 熊靜, 等.嗜水氣單胞菌在歐洲鰻鱺體內(nèi)的免疫組織化學(xué)定位與病理觀察［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011, 30（4）：494-499.

［20］ Guo SL, Feng JJ, Yang QH, et al.Immune effects of bathing European eels in live pathogenic bacteria［J］.Aeromonashydrophila.Aquaculture Research, 2012, doi：10.1111/are.12035.

［21］ 郭松林, 關(guān)瑞章, 柳佩娟.雙重PCR法快速檢測歐鰻鱺嗜水氣單胞菌［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 12（4）：294-300.

［22］ 黃曉, 葉成真.嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因Ompts的克隆與序列分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2001, 21（4）：347-349.

［23］ 肖克軍.水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011：250-256.

［24］ 劉永杰, 陸承平.嗜水氣單胞菌彈性蛋白酶的純化及特性分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2006, 26（1）：54-56.

［25］ 楊求華, 郭松林, 關(guān)瑞章, 等.鰻鱺病原性維氏氣單胞菌的分離與鑒定［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2012（7）：134-139.