趙娜 劉社蘭 路紀(jì)琪 何宏軒 趙寶華

人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物在形態(tài)、生理、基因和行為上的近似使得靈長(zhǎng)類成為研究人類疾病的模型，其中恒河猴（Rhesus Macaques）是被研究得最清楚的舊世界猴，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。在恒河猴養(yǎng)殖業(yè)，尤其是處于食性轉(zhuǎn)換期和特殊生理時(shí)期的恒河猴個(gè)體中，由于病毒和腸道病原體傳染造成的疾病嚴(yán)重威脅恒河猴的健康。傳統(tǒng)研究腸道菌群特點(diǎn)的方法主要是選擇性培養(yǎng)，但是由于腸道中大多數(shù)細(xì)菌不能用傳統(tǒng)研究方法進(jìn)行培養(yǎng)、分離和鑒定［1，2］，因此人們對(duì)恒河猴腸道及糞樣微生物的變化規(guī)律知之甚少。

DGGE技術(shù)可以快速檢測(cè)傳統(tǒng)條件不能培養(yǎng)的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)新的微生物，作為微生物分子生態(tài)學(xué)研究的重要手段，被廣泛地應(yīng)用于微生物群落多樣性和動(dòng)態(tài)分析［3］。16S rRNA基因DGGE圖譜條帶數(shù)目可以反映微生物菌群的多樣性，條帶染色后的亮度可以相應(yīng)反映細(xì)菌在群體中的豐度。對(duì)PCR-DGGE分離得到的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序或雜交可以進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的種屬［4，5］。與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)（Real-time PCR）可以對(duì)整個(gè)PCR過程中產(chǎn)物的擴(kuò)增過程加以監(jiān)測(cè)，能夠直觀地反映PCR模板濃度與擴(kuò)增產(chǎn)物含量之間的關(guān)系，具有高度準(zhǔn)確性，目前，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于動(dòng)物腸道菌群檢測(cè)及環(huán)境微生態(tài)的檢測(cè)研究［6］。

McKenna等［7］運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究了慢病毒感染及慢性結(jié)腸炎的恒河猴的腸道微生態(tài)特點(diǎn)，并簡(jiǎn)單與健康恒河猴進(jìn)行比較，但是迄今為止沒有系統(tǒng)關(guān)于不同年齡段健康恒河猴個(gè)體腸道主要菌群多樣性及其特點(diǎn)的報(bào)道。本研究采用PCR-DGGE和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR）技術(shù)研究24只處于6個(gè)不同年齡組、不同生理狀態(tài)的恒河猴個(gè)體糞樣中腸道菌群的變化規(guī)律，從定性和定量的角度加以揭示，以期發(fā)現(xiàn)由于食性改變及生理狀態(tài)改變?cè)斐傻哪c道疾病的根源。

1 材料與方法

1.1 糞樣的收集及處理

選擇飼養(yǎng)在河南省鄭州動(dòng)物園的24只健康恒河猴，嬰幼齡（1月齡）、青年（1-4歲）、亞成年（4-5歲）、成年（5-10歲）、老年（10歲以上）、孕期（懷孕后期，孕齡15-18周）各4只，除了孕期組以外的五組中個(gè)體均雌雄各半。除嬰幼齡個(gè)體母乳喂養(yǎng)外，其他組別個(gè)體均以胡蘿卜、蘋果、馬鈴薯和玉米餅為飼料，每日投喂兩次。2011年2月，每個(gè)個(gè)體取3份樣品，每次取樣間隔1周。

所有72個(gè)糞便樣品在采樣時(shí)均收集在無菌塑料容器內(nèi)，放置在干冰上，30min內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。每份糞便樣品混合均勻后，分裝出3份至滅菌離心管中，200mg每份，然后凍存于-80℃直至分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每個(gè)個(gè)體凍存的3份不同時(shí)間點(diǎn)收集的樣品各一份混合均勻，等量分成3份（200mg每份）。參照Yanfei等［8］方法將樣品加到提前加好300mg0.1mm玻璃珠（Sigma）的2mL破壁管中，加入1.4mL ASL緩沖液（QIAamp DNA Stool Mini Kit）之前，放于冰上。然后于FastPrep FP120震蕩儀上6.5速度震蕩45s，隨后于97℃水浴鍋中5min水浴。隨后參照QIAamp DNA Stool Mini Kit 說明書步驟進(jìn)行。最后，用200μL TE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0）洗脫。取 1μL 于NanoDrop ND-1000測(cè)所提細(xì)菌基因組DNA濃度，其A260/A280在1.6-1.8之間，濃度范圍在50-70ng/μL之間。后將DNA樣品-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

1.2.2.1 PCR擴(kuò)增 為避免非特異性PCR產(chǎn)物出現(xiàn)，16S rRNA V3可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增采用Muyzer等［3］提出的熱啟動(dòng)touchdown方法。由通用引物（F357-GC clamp：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGAGGCAGCAG-3'，R518：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）擴(kuò)增。

25μL反應(yīng)體系包括：1 U TaKaRa Taq熱啟動(dòng)聚合酶，10×PCR buffer，上下游引物各10 pmol，20mmol/L dNTPs，20ng DNA模板。94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸 1min，20個(gè)循環(huán)，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸 1min，5個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5min，4℃ 15min。為消除產(chǎn)物中的異二聚體，采用reconditioning PCR技術(shù)，以20ng的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行reconditioning PCR［9］。反應(yīng)程序如下 ：94℃預(yù)變性 3min，94℃變性20s，56退火30s，72℃延伸30s，5個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃ 15min。1％瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，UVI凝膠成像系統(tǒng)照相記錄，目的條帶200bp，條帶明亮單一，保存產(chǎn)物以進(jìn)行DGGE。

1.2.2.2 DGGE 考慮同張DGGE指紋圖譜比較清晰，且樣品前期處理已經(jīng)做到混合，每組選擇兩個(gè)樣品進(jìn)行DGGE電泳，除孕期恒河猴，其余各組均是雌性個(gè)體和雄性個(gè)體各一。參照Muyzer的方法，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳分離。電泳前，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃縮使所有樣品達(dá)到濃度一致。使用Bio-Rad 公司的D-code Universal Mutation Detection System進(jìn)行DGGE電泳。配置37％-78％（100％變性梯度包含40％去離子甲酰胺和7mol/L尿素）變性范圍的8％聚丙烯酰胺變性膠，16S rRNA基因 V3 區(qū)PCR 產(chǎn)物 15μL+5μL 10×loading buffer 注射針上樣，恒溫60℃，69 V電壓1×TAE緩沖液中電泳16h。

電泳完畢后，使用現(xiàn)稀釋的0.1％SYBER Green I溶液避光染色2次，每次30min。染色結(jié)束后用去離子水沖洗膠2次，于UVI自動(dòng)凝膠成像儀中拍照。對(duì)DGGE凝膠上感興趣的條帶，進(jìn)行割膠回收。

1.2.3 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增及克隆測(cè)序

1.2.3.1 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 DGGE割膠條帶放入50μL RNA free H2O的離心管中，4℃浸泡過夜。取2μL浸泡液作為模板，無GC夾子引物F357和R518各10 pmol進(jìn)行PCR擴(kuò)增。程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性 20s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃ 15min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳拍照確定陽性條帶后，用天根公司DNA回收試劑盒回收。

1.2.3.2 克隆測(cè)序 回收產(chǎn)物連接Promega公司pGEM-T Easy Vector并轉(zhuǎn)化 Escherichia coli DH5α cells。為確保正確插入，陽性克隆子再度用pGEM-T 特異性引物 T7（5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'）和 Sp6（5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3'）進(jìn)行驗(yàn)證。正確插入的克隆子重新重復(fù)之前DGGE的步驟進(jìn)行DGGE電泳，確定電泳條帶的正確性。電泳位置與之前一致的條帶DNA送北京華大基因測(cè)序，每個(gè)條帶的平板測(cè)4個(gè)陽性克隆。

1.2.3.3 DNA序列進(jìn)化樹構(gòu)建 BLAST軟件分析序列去除載體序列并對(duì)序列加以整理對(duì)齊。將整理后的序列信息導(dǎo)入MOTHUR軟件，按照97％的相似性標(biāo)準(zhǔn)，將這些序列劃分分類操作單元（OTU）。將這些OTU序列與NCBI GenBank的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，下載相似性較高的序列，BLAST處理后作為背景序列與測(cè)序所得序列一起導(dǎo)入MEGA5采用鄰接算法進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹［10］。

1.2.4 DGGE分析 采用Quantity? One 1-D Analysis software對(duì)DGGE凝膠圖譜進(jìn)行標(biāo)化處理，根據(jù)圖譜中各條帶數(shù)目、遷移位置和強(qiáng)度進(jìn)行膠的數(shù)字化處理，應(yīng)用UPGMA算法進(jìn)行泳道相似性聚類分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB 2008進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCoA）。主成分分析是將一組變量上分散的信息進(jìn)行集中，主要對(duì)某幾個(gè)綜合性指標(biāo)（主成分）進(jìn)行探索性統(tǒng)計(jì)的分析方法。對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行PCoA分析可以彌補(bǔ)相似性聚類分析受背景及其他無關(guān)因素影響的缺點(diǎn)，可以得到樣品間是否存在差異，PCoA載荷量分析可以進(jìn)而得到造成這種差異的原因［11，12］。對(duì)PCR-DGGE分離得到的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序或雜交可以進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的種屬。

1.2.5 腸道優(yōu)勢(shì)菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 采用美國 Bio-Rad 公司 DNA Engine Opticon? 2 apparatus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)腸道菌群進(jìn)行定量，菌屬特異性引物，見表 1。20μL 擴(kuò)增體系由 10μL SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa），300nmol/L引物以及 1μL 模板 DNA組成。每個(gè)反應(yīng)都重復(fù)3次。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性5min，95℃變性30s，退火30s，72℃延伸40s，執(zhí)行40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)結(jié)束后維持81℃ 10s，以避免引物二聚體、二級(jí)結(jié)構(gòu)，收集熒光信號(hào)。最后72℃延伸5min。每組引物的退火溫度，見表1。每個(gè)熒光定量反應(yīng)均以濃度101-108copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)菌種16S rRNA基因片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher’s Exact Test 和one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組數(shù)據(jù)分別以各自的“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。樣本基因的拷貝數(shù)以每克濕重樣品中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)值表示。

2 結(jié)果

2.1 腸道微生物群落組間和組內(nèi)差異的DGGE圖譜

圖1-A是不同組別16S rRNA基因V3可變區(qū)PCR-DGGE圖譜，條帶反映了糞樣中的優(yōu)勢(shì)菌群，其數(shù)量和位置的差異顯示了各個(gè)組別和各個(gè)體之間菌群的多樣性。對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，將DGGE指紋圖譜按遷移位置標(biāo)號(hào)共有50條電泳條帶。DGGE圖譜經(jīng)泳道相似性分析顯示屬于明顯的2組（圖1-A），其中嬰幼齡組和孕期組、成年組可歸為一組，其他3組歸為一組，帶譜間相似性均大于60％。嬰幼齡組和孕期組相似性最高，大于67％。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化矩陣主成分分析，能夠更直觀地看到不同組別之間腸道菌群的差異。PCoA圖上兩點(diǎn)間距離越近表明主要菌群結(jié)構(gòu)組成上的相似性越高，反之，則相似性越低。圖1-B顯示在主成分27.8％（X軸方向）和21.6％（Y軸方向）時(shí)，嬰幼齡組和孕期組有明顯的聚類。這些結(jié)果表明，處于哺乳期的嬰幼齡個(gè)體與懷孕期個(gè)體具有相似的腸道優(yōu)勢(shì)菌群。

圖1-C主成分載荷值分析得到導(dǎo)致主成分分析聚類的主要3條條帶（圖1-A中的A、B、C3條條帶），對(duì)應(yīng)DGGE圖譜進(jìn)行割膠、克隆、測(cè)序鑒定，比對(duì)結(jié)果顯示它們分別是Ruminococcus bromii（98％，GenBank登錄號(hào)DQ882649.1），Bifidobacterium dentium（98％，GenBank登錄號(hào)HQ697642.1）和Lactobacillushelveticus（99％，GenBank登 錄 號(hào) HQ61664-3.1），百分?jǐn)?shù)顯示與GenBank比對(duì)后的序列相似性。

對(duì)DGGE圖譜中50個(gè)電泳條帶進(jìn)行割膠，由于不能排除不同的堿基序列遷移到相同位置的可能，本研究共割膠62條，隨后進(jìn)行克隆，測(cè)序后用MOTHUR軟件分析所有62個(gè)條帶屬于43個(gè)OTU。與GenBank序列進(jìn)行比對(duì)后構(gòu)建進(jìn)化樹顯示所有62個(gè)條帶、43個(gè)OTUs屬于4個(gè)門：厚壁菌門（33/43 OTUs，47/62 DNA 序列），放線菌門（4/43 OTUs，8/62 DNA序列），擬桿菌門（5/43 OTUs，6/62 DNA序列）以及螺旋體門（1/43 OTUs，1/62 DNA序列），絕大多數(shù)條帶都屬于厚壁菌門（圖2）。

2.2 不同年齡組恒河猴腸道優(yōu)勢(shì)菌種的定量結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果（表2）顯示在所有恒河猴腸道優(yōu)勢(shì)菌中，梭菌屬和雙歧桿菌最為豐富，將近109copies/g。腸球菌屬最少，不到104copies/g。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示梭菌屬clusters ⅪⅤ，腸球菌屬和擬桿菌-普氏菌屬組間差異明顯（P＜0.01）。另外梭菌屬clusters Ⅰ，clusters Ⅺ和乳酸桿菌也有較顯著差異（P＜0.05）。

a：梭狀芽孢桿菌分組參考文獻(xiàn)［14］；b：乳酸桿菌包括乳酸桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬［15］；c：梭菌屬clustersⅠ、梭菌屬clusters Ⅺ、梭菌屬clusters ⅪⅤ和柔嫩梭菌屬均屬于梭狀芽孢桿菌

圖1 16S rRNA基因V3區(qū)DGGE指紋圖譜

組間統(tǒng)計(jì)分析顯示同種細(xì)菌在不同年齡恒河猴腸道中的定值存在差異。其中青年恒河猴腸道中擬桿菌-普氏菌屬基因拷貝數(shù)，與嬰幼齡恒河猴相比有明顯增多（P=0.049），梭菌屬clusters Ⅺ則減少明顯（P=0.021）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示老年組恒河猴擬桿菌-普氏菌屬細(xì)菌拷貝數(shù)，與成年組相比顯著增多（P=0.000）。而孕期組恒河猴腸桿菌拷貝數(shù)明顯高于同齡未懷孕亞成年和成年恒河猴（P=0.007和P=0.012）；梭菌屬clusters Ⅺ拷貝數(shù)則明顯低于同齡未懷孕亞成年和成年恒河猴（P=0.017和P=0.023）。圖3顯示，作為顯示腸道健康水平標(biāo)準(zhǔn)的雙歧桿菌和腸桿菌比值（B/E值）與同齡亞成年和成年組恒河猴相比，在孕期恒河猴組有明顯的降低（P=0.002和 P=0.009）。

圖3 不同年齡組雙歧桿菌和腸桿菌比值（B/E值）的變化趨勢(shì)

另外，q-PCR結(jié)果（表2）顯示腸道梭狀芽孢桿菌數(shù)量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與PCR-DGGE割膠條帶測(cè)序結(jié)果（厚壁菌門，33/43 OTUs，47/62 DNA序列）一致。

3 討論

PCR-DGGE方法最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴于培養(yǎng)過程，根據(jù)不同變性范圍DNA片段的溶解性而使之分離，因此，近年來分子微生態(tài)學(xué)研究采用PCR-DGGE技術(shù)用以區(qū)分各微生境中的優(yōu)勢(shì)菌群，反映其菌群結(jié)構(gòu)多樣性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅能夠監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程中產(chǎn)物的擴(kuò)增情況，具有較高準(zhǔn)確度，又因?yàn)樵摷夹g(shù)能夠在很低模板濃度下進(jìn)行準(zhǔn)確定量，因而被廣泛用于人類及其他動(dòng)物腸道菌群方面的研究中。本研究首次采用這兩項(xiàng)技術(shù)研究不同年齡和不同生理狀態(tài)的中國恒河猴糞樣菌群的多樣性。研究結(jié)果表明，PCR-DGGE和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在研究恒河猴腸道菌群多樣性上非常有效。

圖2 16S rRNA基因V3區(qū)進(jìn)化樹構(gòu)建

本研究采集24只不同年齡、不同生理狀況的恒河猴糞樣，分析其腸道菌群的變化。研究結(jié)果顯示，母乳喂養(yǎng)階段的嬰幼齡組恒河猴腸道DGGE圖譜與孕期組恒河猴相似度高于67％，主成分分析顯示二者出現(xiàn)明顯聚類。主成分分析載荷值顯示代謝相關(guān)功能菌Ruminococcus bromii，健康密切相關(guān)益生菌Bifidobacterium dentium和Lactobacillushelveticu為造成聚類的主要差異條帶。有報(bào)道稱嬰幼兒腸道菌群處于紊亂狀態(tài)［16，17］，Jeremy 等［18］報(bào)道嬰兒體內(nèi)腸道微生態(tài)處于紊亂的狀態(tài)可能跟日常飲食和身體狀況有關(guān)，但是機(jī)制尚不明確。而在孕期個(gè)體中，性激素可以通過膽汁分泌而分泌，接下來的細(xì)菌代謝導(dǎo)致苷配基和脫硫酸鹽的產(chǎn)生，這兩種成分會(huì)造成膽汁酸的重吸收，引發(fā)疾?。?9-21］。還有很多關(guān)于健康女性在月經(jīng)期和排卵期胃腸性疾病增多的報(bào)道，他們認(rèn)為這些情況與雌激素和黃體酮水平的改變密切相關(guān)。關(guān)于胃腸型疾病的發(fā)生與性激素分泌的關(guān)系方面恰恰也有相反的報(bào)道，但是這些都清楚表明二者存在必然聯(lián)系，而我們現(xiàn)在無法確定這種聯(lián)系是不是導(dǎo)致嬰幼齡組和孕期組聚類的原因［22，23］。很多研究證明腸道菌群狀態(tài)與宿主的能量代謝有關(guān)，或許這也是導(dǎo)致聚類的原因。與之前的報(bào)道不同［24，25］，在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)腸道菌群與性別之間的關(guān)系。

表2 不同年齡組中各個(gè)種屬細(xì)菌實(shí)時(shí)熒光定量q-PCR結(jié)果

Q-PCR結(jié)果顯示青年組與嬰幼齡組相比，擬桿菌和梭菌clusters Ⅺ差異顯著；老年組較之成年組，擬桿菌數(shù)量也顯著增多；與同齡亞成年和成年個(gè)體相比，孕期組梭菌clusters Ⅺ和腸桿菌數(shù)量有顯著差異，用以衡量腸道健康狀況的雙歧桿菌和腸桿菌比值（B/E值）［26］顯著低下。這些對(duì)于因斷乳等食性轉(zhuǎn)換、生理性免疫功能低下、生理性激素水平變化等造成的恒河猴腸道疾病具有一定的指示意義。

本研究中的母乳喂養(yǎng)期的嬰幼齡與孕期恒河猴腸道主要菌群特點(diǎn)相似尚屬首次發(fā)現(xiàn)，接下來我們會(huì)有針對(duì)性地展開研究，同時(shí)對(duì)患病個(gè)體樣品和健康個(gè)體進(jìn)行比較，以期發(fā)現(xiàn)腸道菌群變化與疾病的潛在發(fā)生之間的規(guī)律。

4 結(jié)論

（1）以梭桿菌為主的厚壁菌門細(xì)菌是恒河猴腸道的主要優(yōu)勢(shì)菌群，另外也有放線菌門、擬桿菌門和螺旋體門細(xì)菌的分布。

（2）恒河猴嬰幼齡組和孕期組出現(xiàn)明顯聚類，很可能與激素分泌密切相關(guān)。主成分載荷值顯示代謝相關(guān)功能菌R.bromii，健康密切相關(guān)益生菌Bif.dentium和Lac.helveticus為造成聚類的主要差異條帶。

（3）處于食性轉(zhuǎn)換期的青年組、免疫力下降的老年組以及體內(nèi)激素水平發(fā)生變化的孕期組恒河猴腸道主要菌群水平有不同程度的改變。作為顯示腸道健康水平標(biāo)準(zhǔn)的雙歧桿菌和腸桿菌比值（B/E值）與同齡亞成年和成年組恒河猴相比，在孕期恒河猴有明顯的降低。

［1］ Vaughan EE, Schut F, Heilig HG, et al.Amolecular view of the intestinal ecosystem［J］.Curr Issues Intest Microbiol, 2000, 1：1-12.

［2］ 朱偉云 姚文, 毛勝勇.變性梯度凝膠電泳法研究斷奶仔豬糞樣細(xì)菌區(qū)系變化［J］.微生物學(xué)報(bào), 2003, 43：503-508.

［3］ Muyzer G, De Waal EC, Uitterlinden AG.Profiling of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］.Appl Environ Microbiol, 1993, 59：695-700.

［4］ Walker WA.Role of nutrients and bacterial colonization in the development of intestinalhost defense［J］.J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2000, 30（Suppl 2）：2-7.

［5］ Walter J, Hertel C, Tannock GW, et al.Detection of Lactobacillus,Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella species inhuman feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Appl Environ Microbiol, 2001, 67：2578-2585.

［6］ Byun R, Nadkarni MA, Chhour KL, et al.Quantitative analysis of diverse Lactobacillus species present in advanced dental caries［J］.J Clin Microbiol, 2004, 42：3128-3136.

［7］ Mckenna P, Hoffmann C, Minkah N, et al.Themacaque gutmicrobiome inhealth, lentiviral infection, and chronic enterocolitis［J］.PLoS Pathog, 2008, 4：e20.

［8］ Chen Y, Yang F, Lu H, et al.Characterization of fecalmicrobial communities in patients with liver cirrhosis［J］.Hepatology, 2011,54：562-572.

［9］ Thompson JR, Marcelino LA, Polz MF.Heteroduplexes inmixed-template amplifications：formation, consequence and elimination by reconditioning PCR［J］.Nucleic Acids Res, 2002, 30：2083-2088.

［10］ Kumar S, Tamura K, Nei M.MEGA：Molecular evolutionary genetics analysis software formicrocomputers［J］.Comput Appl Biosci, 1994, 10：189-191.

［11］ Pearson K.On lines and planes of closest fit to systems of points in space［J］.Philosophical Magazine, 1901, 2：559-572.

［12］ Muller AK, Westergaard K, Christensen S, et al.The effect of longtermmercury pollution on the soilmicrobial community［J］.FEMS Microbiol Ecol, 2001, 36：11-19.

［13］ Haarman M, Knol J.Quantitative real-time PCR analysis of fecal Lactobacillus species in infants receiving a prebiotic infant formula［J］.Appl Environ Microbiol, 2006, 72：2359-2365.

［14］ Collins MD, Lawson PA, Willems A, et al.The phylogeny of the genus Clostridium：proposal of five new genera and eleven new species combinations［J］.Int J Syst Bacteriol, 1994, 44：812-826.

［15］ Bartosch S, Fite A, Macfarlane GT, et al.Characterization of bacterial communities in feces fromhealthy elderly volunteers andhospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecalmicrobiota［J］.Appl Environ Microbiol, 2004, 70：3575-3581.

［16］ Palmer C, Bik EM, Digiulio DB, et al.Development of thehuman infant intestinalmicrobiota［J］.PLoS biology, 2007, 5：e177.

［17］ Sela D, Chapman J, Adeuya A, et al.The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp.infantis reveals adaptations formilk utilization within the infantmicrobiome［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105：18964.

［18］ Koenig JE, Spor A, Scalfone N, et al.Succession ofmicrobial consortia in the developing infant gutmicrobiome［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（Suppl.1）：4578-4585.

［19］ Smith RV.Metabolism of drugs and other foreign compounds by intestinalmicroorganisms［J］.World Review of Nutrition and Dietetics, 1978, 29：60.

［20］ Goldman P.Biochemical pharmacology of the intestinal flora［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1978, 18：523-539.

［21］ Grundmann O.The gutmicrobiome and pre-systemicmetabolism：current state and evolving research.J Drug Metabol Toxicol［J］.2010, 1（2）：104-111.

［22］ Kennedy PJ, Clarke G, Quigley EM, et al.Gutmemories：towards a cognitive neurobiology of irritable bowel syndrome［J］.Neurosci Biobehav Rev, 2012, 36：310-340.

［23］ Moore J, Barlow D, Jewell D, et al.Do gastrointestinal symptoms vary with themenstrual cycle?［J］.BJOG：An International Journal of Obstetrics ＆ Gynaecology, 1998, 105：1322-1325.

［24］ Adeyemo M, Spiegel B, Chang L.Meta-analysis：do irritable bowel syndrome symptoms vary betweenmen and women?［J］.Alimentary pharmacology ＆ therapeutics, 2010, 32：738-755.

［25］ Altman G, Cain K C, Motzer S, et al.Increased symptoms in female IBS patients with dysmenorrhea and PMS［J］.Gastroenterol Nurs, 2006, 29：4-11.

［26］ Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, et al.Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gutmicrobiota analysis of Crohn disease patients［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105：16731-16736.