李小芳，馮小強*，楊 聲，王廷璞

1天水師范學(xué)院 生化學(xué)院，天水 741001;2定西師范高等?？茖W(xué)校，定西 743000

血清白蛋白可以與許多內(nèi)源和外源性化合物結(jié)合，藥物要通過血漿的儲運，才能到達受體部位產(chǎn)生藥效。因此，研究藥物分子與蛋白質(zhì)間的相互作用具有重要的理論及實際意義［1，2］。殼聚糖作為一種天然的聚陽離子多糖，具有多種獨特的生物活性和功能，如活化淋巴細胞、增強機體免疫力、抗菌抑菌［3，4］、止血［5］、降低血酯和膽固醇以及抗腫瘤［6］等生物活性。在前期工作中，筆者利用殼聚糖分子結(jié)構(gòu)的特性，制備了羧甲基化殼聚糖季銨鹽(CMCQA)，發(fā)現(xiàn) CMCQA 對常見細菌 St.aureus、E.coli和真菌A.niger具有很好的抑制作用，且對E.coli和St.aureus的最小抑菌濃度值較殼聚糖降低了 5倍［7］，CMCQA有望在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有更為廣泛的應(yīng)用。有關(guān)CMCQA與BSA之間相互作用的研究，目前尚未見報道。本實驗采用光譜法研究了CMCQA與BSA的作用機理，該研究為生命科學(xué)研究提供有用的信息。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

CMCQA(制備方法參見文獻［7］，羧甲基取代度為0.62，季銨鹽取代度為0.54);BSA(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)，配成濃度為10-5mol/L的溶液，在4℃下保存?zhèn)溆?0.05 mol/L的 Tris-HCl(pH=7.2)緩沖溶液，用 0.01 mol/L NaCl溶液配制。RF-5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司)。

1.2 CMCQA與BSA的作用

在10 mL容量瓶中均加入BSA溶液2.0 mL，然后加入不同濃度的CMCQA溶液，以Tris-HCl定容，作用1 h。以280 nm為激發(fā)波長，設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，記錄280～700 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。樣品池為1 cm ×1 cm石英吸收池。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

BSA是內(nèi)源性熒光物質(zhì)，其分子中的色氨酸、酪氨酸殘基均能發(fā)射熒光。在大多數(shù)情況下，認為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻，而且含色氨酸殘基的蛋白質(zhì)的天然熒光及其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身及其周圍環(huán)境的變化［8］。從圖1結(jié)果可以看出，隨著CMCQA濃度的增加，BSA的內(nèi)源熒光強度有規(guī)律地降低，說明CMCQA對BSA的熒光具有猝滅作用，CMCQA與BSA之間發(fā)生了相互作用。

圖1 CMCQA對BSA作用的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of BSA interacted with different concentrations of CMCQA

2.2 對BSA熒光猝滅方式的確定

表1為不同溫度下CMCQA對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程與猝滅常數(shù)。CMCQA對BSA的猝滅常數(shù)均遠遠大于200 L/mol，各類猝滅劑對生物大分子的kq最大值為2.0×1010L·mol-1·s-1［9］，可以初步判斷CMCQA對BSA的熒光猝滅屬于生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。另外，動態(tài)與靜態(tài)猝滅也可依據(jù)不同溫度下的猝滅常數(shù)得以區(qū)別。對動態(tài)猝滅，溫度升高將有利于熒光體和熒光猝滅劑分子之間的有效碰撞，并可以促進電子的轉(zhuǎn)移過程，Ksv隨溫度的升高而增大;若是靜態(tài)猝滅，溫度升高，產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低，靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv減?。?0］。在該研究體系中，CMCQA對BSA的熒光猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，進一步表明CMCQA對BSA的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅，而是生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅［11］。

表1 不同溫度下CMCQA對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程與猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer equations and quenching constants of BSA fluorescence quenching with CMCQA at different temperatures

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

在CMCQA對BSA的熒光靜態(tài)猝滅過程中，假設(shè)生物大分子BSA有n個相同且獨立的結(jié)合位點，可與猝滅劑 CMCQA(稱為 Q)結(jié)合常數(shù)為 kA，則BSA與猝滅劑Q的配合反應(yīng)可表示為:

當Q的濃度遠遠大于BSA濃度時，熒光體系的熒光強度和Q的濃度滿足以下關(guān)系:

根據(jù)方程(2)，lg(F0– F)/F～lgC(Q)曲線擬合可得到方程、平衡常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)見表2所示。在室溫下，CMCQA與BSA的的結(jié)合常數(shù)KA為2.45×104L/mol，CMCQA與BSA的結(jié)合位點數(shù)等于1.04，考慮實驗誤差，認為一個CMCQA分子能與一個BSA分子結(jié)合形成配合物。結(jié)合常數(shù)隨溫度升高而減小，是因為當溫度升高，有利于結(jié)合產(chǎn)物的解離，使得平衡常數(shù)減小。

表2 不同溫度下CMCQA對BSA熒光猝滅對數(shù)方程及其參數(shù)Table 2 Logarithm equations and parameters of BSA fluorescence quenching with CMCQA at room temperatures

2.4 作用力類型的判定

以不同溫度下lnKA對1/T作圖，得到直線y=7.33+823.16 x(r=0.98833)，根據(jù)直線的斜率可以求出ΔH為-6.844 kJ/mol。同樣，根據(jù)熱力學(xué)公式［12］，求得CMCQA與BSA反應(yīng)的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)(見表3)。因此，可認為CMCQA與BSA之間主要是通過靜電引力相互作用。反應(yīng)的ΔH ＜0，表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)，升高溫度將不利于向生成復(fù)合物的方向進行，所以升高溫度致使靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)減小，生成復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，進一步說明CMC-QA對BSA的猝滅是形成復(fù)合物導(dǎo)致靜態(tài)猝滅的過程。

表3 CMCQA與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Themodynamic parameters of the interaction between CMCQA and BSA

3 結(jié)論

CMCQA與BSA之間通過靜電引力相互作用，對BSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅。在室溫下，CMCQA與BSA的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)n分別為2.45×104L/mol和1.04。說明CMCQA對白蛋白的構(gòu)象和分子能級都有明顯作用，很可能CMCQA是一類具有明顯的抗菌、抗病毒等活性的藥物。

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