李云雙,周 虹,鐘德馨,方袁夢(mèng)夢(mèng),王萬軍,廖 海,周嘉裕
西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610031
類黃酮物質(zhì)是一類重要的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物,在植物花色形成、植物育種、抵抗紫外線輻射、防止病原微生物侵染中都發(fā)揮了重要作用。并且,類黃酮物質(zhì)還具有預(yù)防心血管疾病、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗菌、抗炎等多種生物活性,是一些藥用植物的主要活性成分[1]。查爾酮合成酶(Chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)是植物中類黃酮物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶,是調(diào)控植物類黃酮物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因之一。CHS催化該途徑的第一步,即丙二酰單酰CoA和香豆酰CoA縮合形成具有C15骨架的黃酮類化合物-查爾酮。此中間物的異構(gòu)化和功能基團(tuán)的進(jìn)一步取代都能導(dǎo)致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成。目前,已從多種植物中克隆了CHS基因,包括蘭花、矮牽牛、擬南芥、金魚草和歐洲赤松等[2]。但是,迄今為止僅有苜蓿(Medicago sativa)中的CHS有X-ray晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道,并用于CHS催化機(jī)制的研究[3]。
決明(Senna tora)為豆科草本植物,其干燥成熟種子被稱為決明子。決明子是一種常用的中藥,有效成分主要是蒽醌類及黃酮類化合物[4]。鑒于CHS在植物生理生化活動(dòng)中的重要性,有關(guān)CHS結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及分子工程的研究已成為植物生理生化及分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。本課題組在前期研究中已獲得決明CHS基因的全長(zhǎng)cDNA序列[5]。在此基礎(chǔ)上,本文利用已有苜蓿CHS晶體結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行決明CHS三維結(jié)構(gòu)的同源建模,并對(duì)獲得的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬和合理性驗(yàn)證,再將該模型與香豆酰CoA、丙二酸單酰CoA進(jìn)行分子對(duì)接,為利用此類CHS三維模型研究其催化機(jī)理和分子工程改造奠定基礎(chǔ)。
決明CHS的一級(jí)序列(編號(hào):ACB78187.1)來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb)中用protein blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)方法搜尋同源性和一致性較高且已知晶體結(jié)構(gòu)的蛋白為模板。利用Discovery StudioTM(DS)2.5(Accelrys,San Diego,USA;http://accelrys.com/products/discovery-studio/)的 Align Multiple Sequence模塊對(duì)決明CHS進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并與苜蓿CHS進(jìn)行序列比對(duì)。然后將目標(biāo)與模板序列提交到自動(dòng)建模服務(wù)器SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org),得到初始模型。利用DS的Proteins Superimposing模塊疊合決明CHS與苜蓿CHS的三維結(jié)構(gòu)。
采用分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算能量最小化的方法來優(yōu)化不利的非共價(jià)接觸,保持正確的肽鍵構(gòu)型及能量最低狀態(tài)。本文選用Discovery StudioTM(DS)2.5的能量最小化(EM)和分子動(dòng)力學(xué)模擬(DM)模塊對(duì)初始模型進(jìn)行能量?jī)?yōu)化,力場(chǎng)為CHARMm力場(chǎng)。能量?jī)?yōu)化的步驟為:(1)Minimization_1:考慮到溶劑化效應(yīng),首先將初始模型放入正立方體的TIP3P水模型中溶解,對(duì)整個(gè)體系采用1000步最陡下降法(Steepest Descent)優(yōu)化;(2)Minimization_2:應(yīng)用5000步共軛梯度法(Conjugate Gradient)進(jìn)一步優(yōu)化;(3)Heating:從50 K到300 K梯度進(jìn)行5 000步的動(dòng)態(tài)模擬;(4)Equilibration:在熱力學(xué)溫度(T=300 K)進(jìn)行了1000ps的分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算,模擬步長(zhǎng)為1 ps,每隔500fs收集1個(gè)分子構(gòu)象保存到結(jié)果文件中,選定能量最低的構(gòu)象為最終的建模結(jié)果。
利用在線軟件PROCHECK驗(yàn)證立體化學(xué)性質(zhì)的合理性;利用ERRAT(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/)評(píng)估模型的構(gòu)建精煉程度;利用Profile_3D對(duì)模建結(jié)構(gòu)中氨基酸序列的相容性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)打分。
丙二酸單酰輔酶A(Compound ID:10663;MF:C24H38N7O19P3S)和對(duì)-香豆酰輔酶A(Compound ID:5280329;MF:C30H42N7O18P3S)的結(jié)構(gòu)來源于NCBI Pubchem(http://Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù),并進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化備用。
利用Molegro Virtual Docker(MVD)(http//:www.molegro.com/products.php)軟件的Detect Cavities模塊尋找配體結(jié)合口袋。在相同的對(duì)接條件下,利用MVD的Docking Wizard將配體(對(duì)-香豆酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A)與決明CHS進(jìn)行對(duì)接。根據(jù)構(gòu)象聚類分析的結(jié)果,選取最低能量構(gòu)象作為最終結(jié)合構(gòu)象,生成決明CHS與配體的復(fù)合物結(jié)構(gòu),并進(jìn)行能量最小化(EM)和動(dòng)力學(xué)模擬(MD),用于底物結(jié)合位點(diǎn)和催化機(jī)制的分析。
PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果表明,苜蓿CHS的氨基酸序列與決明CHS的氨基酸序列同源性最高,一致性(Identity)為88%,相似性(Positives)為95%,因此選擇苜蓿CHS晶體(PDB編號(hào):1CHW_B)作為同源建模的模板。對(duì)決明CHS進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并與苜蓿CHS進(jìn)行序列比對(duì)(圖1),預(yù)測(cè)結(jié)果表明決明CHS中有13個(gè)α螺旋,占32.82%,15個(gè)β折疊,占19.23%,無規(guī)則卷曲占47.95%。將決明CHS與苜蓿CHS序列提交到自動(dòng)建模服務(wù)器SWISS-MODEL,獲得了決明CHS的初始模型。初始模型與模板疊合后的root-mean-square deviation(RMSD)值為0.105?,表明決明CHS的三維結(jié)構(gòu)與苜蓿CHS的三維結(jié)構(gòu)十分相似(圖2)。
圖1 決明CHS與苜蓿CHS的序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of Chalcone synthase from S.tora and M.sativa using proteins aligning module of DS,the secondary structure was demonstrated with“α”for α-helices,“β”for β-sheets and“c”for random coils
圖2 模型決明CHS與模板苜蓿CHS的三維結(jié)構(gòu)疊合Fig.2 3D superimposition structure of Chalcone synthase from S.tora and M.sativa,the yellow ribbon represented the model and the red one represented the template
利用PROCHECK分析優(yōu)化后模型的立體化學(xué)合理性,模型的主鏈和側(cè)鏈立體化學(xué)構(gòu)型均較為合理,并且從Ramachandran圖(圖3)中可見該模型的主鏈結(jié)構(gòu)合理:蛋白的φ、ψ二面角90.6%在核心區(qū)域,9.1%在允許區(qū)域,絕大多數(shù)φ-ψ角均在正常范圍內(nèi),沒有落在不允許區(qū)域內(nèi)的殘基。用ERRAT對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估,得到其綜合質(zhì)量因子為93.684,表面模型的精煉程度符合分析要求。用Profile-3D對(duì)模建結(jié)構(gòu)中氨基酸序列的相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖4),結(jié)果顯示大約95.64%的殘基的得分均大于0.2,表面該模型的側(cè)鏈環(huán)境是合理的。以上分析結(jié)果表明,決明CHS的三維結(jié)構(gòu)模型能夠用于對(duì)接研究。
圖3 決明CHS建模結(jié)構(gòu)的Ramachandran plotFig.3 Ramachandran plot of the modeled structure of Chalcone synthase from S.tora
為了進(jìn)一步確定模型的穩(wěn)定性,分別將決明CHS,決明CHS-丙二酰輔酶A復(fù)合物和決明CHS-(對(duì)-香豆酰輔酶A)復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬,計(jì)算得到模擬過程中所有構(gòu)象與初始構(gòu)象的RMSD值。如圖5所示,在100 ps的平衡模擬的軌跡中,決明CHS-丙二酰輔酶A復(fù)合物和CHS-(對(duì)-香豆酰輔酶A)復(fù)合物的RMSD值(0.442?與0.472?)均低于決明CHS的RMSD值(0.852?)。該結(jié)果表明當(dāng)CHS-配體復(fù)合物形成后,由于配體與酶分子間存在大量的氫鍵和范德華力,使得CHS的三維結(jié)構(gòu)更趨于穩(wěn)定。
圖4 決明CHS建模結(jié)構(gòu)的Profile-3D圖Fig.4 Profile-3D score of the modeled structure of Chalcone synthase from S.tora
圖5 動(dòng)力學(xué)模擬過程中所有構(gòu)象與初始構(gòu)象的均方根偏差值(RMSD)Fig.5 The root-mean-square deviations(RMSD)calculated for backbone atoms of ligands-bound complex and for backbone atoms of SMT without ligands during MD simulations
與苜蓿CHS類似,決明CHS的三維結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域:對(duì)-香豆酰輔酶A結(jié)合域與丙二酰輔酶A結(jié)合域[3]。對(duì)-香豆酰輔酶A結(jié)合域主要由 133Ser、164Cys、193Ile、194Thr、197Thr、210Val、254Ile、263Leu、265Phe、269Lys、305Gly、338 Ser 和374Gly等殘基構(gòu)成。對(duì)-香豆酰輔酶A與決明CHS對(duì)接后,其 MolDockScore為-188.745,結(jié)合自由能為-242.575KJ/mol。對(duì)-香豆酰輔酶 A結(jié)合域中133Ser、164 Cys、194Thr、197Thr、269Lys、305Gly、338 Ser與374Gly等殘基與對(duì)-香豆酰輔酶A形成氫鍵,剩余的殘基(193Ile、210Val、254Ile、263Leu、265Phe)與對(duì)-香豆酰輔酶A通過范德華力相互作用,從而穩(wěn)固對(duì)-香豆酰輔酶A在復(fù)合物的空間位置(圖6)。對(duì)-香豆酰輔酶A分子中的泛硫醇部分伸入到CHS酶中,從而定位了最后的已連接硫酯的底物結(jié)合于殘基Cys 164(催化殘基)上。Cys 164的巰基硫原子與對(duì)-香豆酰輔酶A分子中香豆?;踉有纬蓺滏I,距離為 3.412 ?。
圖6 對(duì)-香豆酰輔酶A與決明查爾酮合酶的結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Binding sites of p-coumaroyl-CoA with Chalcone synthase from S.tora
丙二酰輔酶 A結(jié)合域主要由 Lys55、Met59、Lys62、Ser133、Cys164、Thr197、Leu206、Asp207、Val210、Phe215、Ile254、Phe265、Val271、Gly305、Gly306和Ala308等殘基構(gòu)成。丙二酰輔酶A與決明CHS對(duì)接后,其 MolDockScore為-180.226,結(jié)合自由能為-220.396 KJ/mol。丙二酰輔酶A結(jié)合域中Met59、Ser133、Asp207與Gly305等殘基與丙二酰輔酶 A形成氫鍵,剩余的殘基(Lys55、Lys62、Cys164、Thr197、Leu206、Val210、Phe215、Ile254、Phe265、Val271、Gly306、Ala308)與丙二酰輔酶 A 通過范德華力相互作用,從而穩(wěn)固丙二酰輔酶A在復(fù)合物的空間位置(圖7)。
圖7 丙二酰輔酶A與決明查爾酮合酶的結(jié)合位點(diǎn)Fig.7 Binding sites of malonyl-CoA with Chalcone synthase from S.tora
如上所示,底物與查爾酮合酶特異性結(jié)合的立體化學(xué)特征闡明了 Cys164、Phe215、Phe265、His303、Asn336在反應(yīng)機(jī)制中的作用[5]。Phe215和Phe265主要負(fù)責(zé)底物丙二酸單酰輔酶A結(jié)合的特定方向,從而控制聚酮中間物的延伸。Cys164的巰基氫原子與 His303咪唑環(huán)上的 N原子相距3.493 ?,Cys164、His303與活性中心的H2O能夠形成電子傳遞體系。首先,水分子轉(zhuǎn)移1個(gè)電子至His303的咪唑環(huán)上,然后該電子再轉(zhuǎn)移至Cys164的巰基上使后者為負(fù)電子基團(tuán)。隨后該負(fù)電子基團(tuán)進(jìn)攻對(duì)-香豆酰輔酶A的香豆?;?,形成1分子CHS-對(duì)-香豆酰基的中間產(chǎn)物,而輔酶A從CHS中分離出來[3](圖8)。
圖8 對(duì)-香豆酰輔酶A與決明CHS結(jié)合產(chǎn)生單烯酮中間產(chǎn)物的假設(shè)機(jī)制Fig.8 Hypothetical mechanism for p-coumaroyl-CoA binding with CHS from S.tora with the generation of a monoketide intermediate
查爾酮合成酶(CHS)是植物中類黃酮生物合成途徑的關(guān)鍵酶,是調(diào)控植物類黃酮物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因之一,對(duì)植物具有非常重要的意義。迄今為止未有CHS與對(duì)-香豆酰CoA復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)報(bào)道,使得人們無法進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CHS與對(duì)-香豆酰輔酶A的結(jié)合與催化機(jī)制。因此,本研究利用同源建模的方法構(gòu)建決明CHS的三維模型,PROCHECK與Profile-3D檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型中幾乎所有氨基酸殘基的二面角與側(cè)鏈環(huán)境均處于合理區(qū),表明所建模型可信度高,能夠用于后續(xù)的對(duì)接研究。通過分子對(duì)接,篩選到若干與底物(對(duì)-香豆酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A)結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基,它們主要通過氫鍵、范德華力與底物結(jié)合,從而穩(wěn)定底物在酶分子中的空間位置。根據(jù)CHS的酶學(xué)特性與對(duì)接結(jié)果,推測(cè)決明CHS中Cys164、His303與活性中心的H2O能夠形成電子傳遞體系,參與酶促反應(yīng)過程。以上研究成果能夠?yàn)槔么祟怌HS三維模型研究其催化機(jī)理和分子工程改造奠定基礎(chǔ)。
1 Ma LQ(馬蘭青),Shi GL(師光祿),Ye HC(葉和春),et al.Plant-specific type III polyketide synthase superfamily:gene structure,function and metabolistes.Chin J Biotechnol(生物工程學(xué)報(bào)),2010,26:1482-1492.
2 Dao TTH,Linthorst HJM,Verpoorte R.Chalcone synthase and its functions in plant resistance.Phytochem Rev,2011,10:397-412.
3 Ferrer JL,Jez JM,Bowman ME,et al.Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis.Nat Struc Biol,1999,6:775-784.
4 Hao YJ(郝延軍),Shang YL(桑育黎),Zhao YQ(趙余慶),et al.The progress of Cassia tora.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥),2001,32:858-859.
5 Liao H(廖海),Zhou JY(周嘉裕).Molecular cloning and analysis of a Chalone synthase gene of Cassia tora.Acta Botan Boreali-Occidentalia Sin(西北植物學(xué)報(bào)),2008,28:1728-1733.