宋 航，張 含，劉 銘，許繼敏，耿 越

山東省動(dòng)物抗性生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生命科學(xué)學(xué)院山東師范大學(xué)，濟(jì)南 250014

肥胖是由于食物攝入過(guò)多或機(jī)體代謝改變而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過(guò)多造成體重的過(guò)度增長(zhǎng)，并引發(fā)機(jī)體生理病理性改變?，F(xiàn)代人常見(jiàn)的飲食無(wú)序、長(zhǎng)久靜坐、缺乏運(yùn)動(dòng)等生活方式會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂肪代謝率下降，積累過(guò)多會(huì)形成肥胖，進(jìn)而容易可引發(fā)心臟病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝等多種疾病。所以尋找合適的方法促進(jìn)體內(nèi)脂質(zhì)代謝對(duì)于預(yù)防肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要意義。

松花粉入藥為松黃，在我國(guó)多部醫(yī)書(shū)中曾有“久服輕身益氣力”、“久服令輕身”等記載，藥用和食用歷史悠久。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)松花粉有益成分、藥理作用和生理功能進(jìn)行了大量的相關(guān)研究。據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析，馬尾松花粉含有18種人體必需的氨基酸和10多種維生素以及核酸、酶類、黃酮類、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維等有益降血脂的物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)破壁松花粉在降低體脂質(zhì)水平和增加脂質(zhì)排泄方面具有良好的效果。

本實(shí)驗(yàn)以破壁馬尾松花粉為原料，進(jìn)一步探討松花粉中醇提物組分對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)控及預(yù)防肥胖的初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 破壁馬尾松花粉

破壁馬尾松(Pinus massoniana)花粉由煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)提供，破壁率大于95%。破壁方法采用低溫氣流粉碎法［1］。

1.2 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方法

選取100只4周齡昆明白雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，篩選出初體重為(19±1)g的小鼠60只，隨機(jī)分為6組:松花粉醇提物低劑量(EEL，0.0625 g/kg bw·d)、中劑量(EEM，0.125 g/kg bw·d)和高劑量(EEH，0.25g/kg bw·d)三個(gè)組;奧利司他陽(yáng)性對(duì)照組(PC，0.05g/kg bw·d);空白對(duì)照組(NC)和高脂飼糧組(FC)。

小鼠飼養(yǎng)環(huán)境及操作:每籠5只;環(huán)境溫度(22±2)℃，濕度30% ～70%;日光燈照明12 h交替;自由進(jìn)食，NC組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼糧，其余各組喂養(yǎng)高脂飼糧;每日下午3～4點(diǎn)進(jìn)行灌胃操作，醇提物和奧利司他都溶于大豆油中，3個(gè)醇提物實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠分別灌胃約0.3 mL;每3 d記錄體重;飼養(yǎng)6周后，禁食12 h;眼球摘除取血，之后引頸處死;解剖小鼠取腎臟周?chē)约安G丸周?chē)闹?，取小鼠肝臟，均迅速置于-80℃冰箱中保存待測(cè)。

小鼠血液取出后于室溫靜置2 h后置于(4～8)℃冰箱中靜置過(guò)夜，10000 rpm離心10 min，取上清待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

1.3.1 基礎(chǔ)飼糧

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室普通小鼠飼糧。

1.3.2 高脂飼糧

組成為75%基礎(chǔ)飼糧，15%豬油，10%伊利全脂奶粉。

1.3.3 馬尾松花粉醇提物由本實(shí)驗(yàn)室制備

3.5kg的破壁馬尾松花粉，乙醇三次浸提，料液比分別為:1∶10、1∶5 和 1∶5。超聲 2 h，頻率 26.4 kHz、提取溫度50℃，攪拌轉(zhuǎn)速:27 rpm。合并三次所得提取液，靜置，取澄清液體。旋蒸濃縮，溫度45℃，真空度0.1 MPa，直到?jīng)]有乙醇味道為止。得到497 g浸膏，得率為14.2%(1g醇提物相當(dāng)于7.04 g馬尾松花粉)。

1.3.4 陽(yáng)性對(duì)照物

奧利司他(orlistat，濟(jì)南偉都化工有限公司)，HPLC純度98.2%，溶于大豆油中。

1.3.5 試劑盒

總膽固醇(TC，CHO酶法)、甘油三酯(TG，酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC，選擇性沉淀法)試劑盒均購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司;脂肪因子(瘦素LEP、脂聯(lián)素ADP、抵抗素Resistin)試劑盒為上海雅吉生物科技有限公司小鼠Elisa試劑盒;肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(CPT-I)(天潤(rùn)生物科技有限公司代測(cè));蛋白質(zhì)定量(南京建成生物科技有限公司BCA蛋白定量法)。

1.3.6 儀器設(shè)備

GDC-TQ/ZS/4中試型多功能超聲波提取及濃縮設(shè)備(濟(jì)南金百特工程機(jī)械有限公司);GQ105高速管式分離機(jī)(上海浦東天本離心機(jī)械有限公司);SB1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA);BS 124 S電子天平(Sartorius);5804 R低溫離心機(jī)(Eppendorf);Stat Fax-2100酶標(biāo)儀(AWARENESS);RT-1904C生化分析儀。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

測(cè)定指標(biāo)包括:終體重(final weight);體重凈增加(weight net increase)=實(shí)驗(yàn)終體重－實(shí)驗(yàn)初體重;體重增長(zhǎng)率(weight gain rate)=體重增量/實(shí)驗(yàn)初體重×100%;體脂總重(fat content)=腎臟周?chē)局?睪丸周?chē)局?體脂比(rate of body fat)=體脂總重/實(shí)驗(yàn)?zāi)w重×100%;小鼠血清中脂質(zhì)(TC、TG、HDLC)含量;小鼠血清中脂肪因子(LEP、ADP、Resistin)水平;肝臟及白色脂肪組織中肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(CPT-I)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算各組參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠體重和體脂變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)FC組平均終體重高達(dá)51.64 g，凈增重20.50 g，體重增長(zhǎng)率高達(dá)59.29%，與NC組相比有極顯著性差異(P ＜0.01)，證明肥胖模型建模成功。從表1可見(jiàn)，EEL、EEM和EEH組的終體重與FC組相比都有明顯降低，差異極顯著(P ＜0.01)，同時(shí)在體重凈增加和體重增加率方面也都有明顯降低(P＜0.01);3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的體脂含量與FC組相比都有不同程度的降低，體脂比與FC組相比略有 升高，但無(wú)顯著差異。

表1 小鼠體重和體脂變化(n=5)Table 1 Body weight and fat change of mice(n=5)

2.2 小鼠血清脂質(zhì)水平變化

從表2可見(jiàn)，EEL組(143.47 mg/dl)和EEH組(125.55 mg/dl)與FC 組(173.97 mg/dl)相比TC 含量都明顯降低，并且EEH組有極顯著性差異(P＜0.01);三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的TG含量與FC組相比都有明顯降低，差異極顯著(P＜0.01);HDLC含量與FC組相比也都有極顯著升高(P＜0.01)。

表2 小鼠血清脂質(zhì)水平變化(n=5)Table 2 Differences of lipid profile in mice serum(n=5)

2.3 小鼠血清脂肪因子水平變化

從表3可見(jiàn)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組可以升高LEP水平，與FC組相比差異不顯著;ADP的含量與FC組相比都有不同程度升高，其中EEM組(89.04 ng/mL)有明顯升高，差異極顯著(P＜0.01);Resistin含量與FC組相比都有極顯著升高(P＜0.01)。

表3 小鼠血清脂肪因子水平變化(n=5)Table 3 Adipokines change in mice serum(n=5)

2.4 肝臟和脂肪CPT-Ⅰ含量變化

從表4可見(jiàn)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的肝臟和脂肪CPT-I含量與FC組相比都有明顯升高，差異都具有極顯著性(P ＜0.01)。

表4 肝臟和脂肪CPT-I含量變化(n=5)Table 4 CPT-I changes in mice liver and adipose tissue(n=5)

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明馬尾松花粉醇提物在體重調(diào)節(jié)方面具有良好效果，3個(gè)醇提物實(shí)驗(yàn)組無(wú)論是體重增長(zhǎng)值還是增加率與FC組相比都有顯著降低;體內(nèi)脂肪的堆積與FC組相比較也有明顯減少。但體脂比略有升高，推測(cè)的原因可能是，本實(shí)驗(yàn)僅僅分離了腎臟和睪丸周?chē)闹窘M織，沒(méi)有考慮其他臟器及皮下脂肪的堆積，從而導(dǎo)致比值上升。

膽固醇是人體及動(dòng)物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)，甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，當(dāng)體內(nèi)膽固醇和甘油三酯積累過(guò)多時(shí)，容易形成動(dòng)脈粥樣硬化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)3個(gè)醇提物實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TC和TG的水平相比FC組均得到明顯抑制。根據(jù)樊柏林等［4］研究證實(shí)，破壁松花粉能夠通過(guò)降低血脂起到預(yù)防和控制大鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥形成的作用。同時(shí)趙霖等［3］證實(shí)，破壁松花粉可通過(guò)增加排脂起到調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝的作用。但與本實(shí)驗(yàn)不同的是這些研究采用的是破壁后松花粉的全營(yíng)養(yǎng)成分，并沒(méi)有進(jìn)一步分離組分。在劉杰爾等［5］研究中采用油松松花粉醇提物，在TC和TG指標(biāo)上結(jié)果趨勢(shì)與本研究基本一致。有研究證實(shí)馬尾松花粉脂肪酸成分中含有較高濃度的不飽和脂肪酸［6］，而不飽和脂肪酸是氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)的天然激動(dòng)劑［7，8］。PPARs在體內(nèi)起到提高胰島素敏感性、調(diào)控脂肪酸代謝水平和降低體內(nèi)脂質(zhì)水平的作用［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了松花粉醇提物能夠促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，降低甘油三酯水平。推測(cè)除去花粉壁所含的膳食纖維類物質(zhì)，馬尾松花粉確實(shí)含有能調(diào)節(jié)血脂代謝的成分，對(duì)于促進(jìn)機(jī)體脂質(zhì)代謝、預(yù)防肥胖發(fā)生，均具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)中小鼠在灌胃松花粉后血清中HDLC水平也得到顯著性提升。高密度脂蛋白(HDL)由肝臟合成，然后在卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的作用下催化HDL與游離膽固醇結(jié)合成HDLC，起輸出膽固醇、促進(jìn)膽固醇代謝的作用，其在體內(nèi)含量的高低與動(dòng)脈粥硬化的形成有關(guān)［2，3］。據(jù)醫(yī)書(shū)記載松花粉具有保護(hù)肝臟的功效，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞活性和解毒功能，這一點(diǎn)從肝臟中CPT-I酶含量得到升高可以看出，可能與松花粉含有多種維生素和礦物質(zhì)有關(guān)，維生素和礦物質(zhì)可以作為體內(nèi)多種酶的輔酶或輔助因子促使酶行使催化功能。所以松花粉可以促進(jìn)肝細(xì)胞活性，提高包括合成高密度脂蛋白在內(nèi)的脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶活水平，具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)行相關(guān)合成酶的酶活水平的檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。

ADP由胰島β細(xì)胞分泌促進(jìn)血液中的葡萄糖進(jìn)入肌肉或脂肪組織氧化代謝，有研究證實(shí)ADP可增強(qiáng)骨骼肌中脂肪酸的氧化，抑制血漿游離脂肪酸的升高，還具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用;LEP是由脂肪組織分泌的參與調(diào)節(jié)糖、脂肪及能量代謝的一種肽類激素，能夠減少機(jī)體攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細(xì)胞合成。LEP受體基因突變可導(dǎo)致肥胖并引發(fā)糖尿病。3個(gè)醇提物實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素水平相比FC組均得到明顯提升，LEP水平也有不同程度升高。從體重體脂檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，有效提升ADP和LEP水平能有效抑制肥胖形成。實(shí)驗(yàn)中抵抗素(Resistin)水平相比FC組也有明顯提升，Steppan等［10］證實(shí)，Resistin能夠促使形成胰島素抵抗，引起高血糖癥。所以提升體內(nèi)Resistin的水平并不利于促進(jìn)脂質(zhì)代謝，對(duì)于松花粉醇提物在脂肪因子水平上的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

CPT-I是脂肪酸β氧化最重要的限速酶，促使脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)進(jìn)行β氧化。醇提物實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)肝臟和脂肪的CPT-I含量相比FC組都有明顯提升，甚至超過(guò)了NC組。CPT-I含量的提升對(duì)于體內(nèi)脂質(zhì)氧化代謝起到促進(jìn)作用，從而達(dá)到減少體內(nèi)脂質(zhì)蓄積，進(jìn)而減輕體重。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)多個(gè)角度探討了馬尾松松花粉醇提物在體重調(diào)節(jié)和脂代謝調(diào)控方面的作用。結(jié)果說(shuō)明松花粉醇提物在促進(jìn)脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)積累方面效果顯著，可有效預(yù)防肥胖形成。為臨床減肥藥物的研制提供了很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Chen Y(陳英)，Liu ZH(劉志河)，Yang FL(楊風(fēng)樓)，et al.Pine pollen cold airflow smashing method.CN01115014.9.2002-08-28.

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