盧虹玉，陳曉敏，歐小蕾，毛俊杰，吉宏武

廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088

硇洲馬尾藻(S.naozhouense)屬褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬(Sargassum)海洋大型藻類［1］，俗稱黑菜，廣泛分布于湛江硇洲島海域且已經(jīng)開(kāi)始人工養(yǎng)殖［2］。因其具有清火、解喉毒和利尿等功效，當(dāng)?shù)貪O民每年都大量采集食用，有很高的食用和藥用價(jià)值。但目前關(guān)于硇洲馬尾藻的研究與開(kāi)發(fā)利用報(bào)道較少見(jiàn)，僅有少量報(bào)道對(duì)其基本營(yíng)養(yǎng)成分和多糖進(jìn)行了研究［3，4］，對(duì)其他生物活性成分研究未見(jiàn)報(bào)道。

海藻多酚是海藻中多酚類化合物的總稱，因具有獨(dú)特的生理活性，近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。其中褐藻中存在一類間苯三酚類單寧物質(zhì)，被稱為褐藻多酚(Phlorotannins，PTs)，為間苯三酚衍生物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。大量研究表明，PTs具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗菌、抗凝血等等多種生物活性［5］。本研究擬從硇洲馬尾藻中提取PTs，進(jìn)行體內(nèi)和體外的抗凝血活性研究，為開(kāi)發(fā)新型抗凝血或抗血栓藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料試劑

真空冷凍干燥機(jī)(東京理化)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)，高速冷凍離心機(jī)(日本日立)，UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(東京理化)，回旋流/切向流超濾器(德國(guó)賽多利斯)，蠕動(dòng)泵(美國(guó)BARNANT)，微量移液器(美國(guó)吉爾森)。

硇洲馬尾藻全藻體由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院謝恩義教授鑒定和提供，采集于湛江徐聞。清水洗去表面泥沙及附生物，風(fēng)干后粉碎待用。

昆明小鼠，6～8周齡，雄性;成年新西蘭兔。均由廣東醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物中心提供。

Folin-酚試劑(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司);沒(méi)食子酸(Gallic acid，GA)(中國(guó)藥品生物制品檢定所);阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健有限公司);凝血酶原時(shí)間試劑盒;凝血酶時(shí)間試劑盒(南京建成生物工程研究所);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 褐藻多酚提取

海藻干粉按1∶10(質(zhì)量體積比)加入80%甲醇水溶液，室溫下避光振蕩16 h，過(guò)濾后殘?jiān)貜?fù)浸提2次，合并上清夜，35℃避光真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去甲醇，水溶液以等倍體積乙醚和氯仿分別萃取2次，取水相，超濾(截留分子10K)，得水層內(nèi)液NW1(＞10K高分子量)和水層外液NW2(＜10K低分子量)，真空冷凍干燥至粉末，-20℃保存。

1.2.2 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法［6］測(cè)定多酚含量。上述提取物分別配制成一定濃度。在10 mL容量瓶中加入1 mL待測(cè)液、2 mL 1 mol/L的福林酚試劑乙，搖勻后靜置2 min，緩慢加入6 mL 12%Na2CO3，定容至10 mL，迅速搖勻，室溫放置1 h，765 nm處測(cè)定吸光度。以GA為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=0.1467X+0.0048，R2=0.9995，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.2.3 體內(nèi)抗凝血活性

1.2.3.1 凝血時(shí)間(coagulation time，CT)測(cè)定(毛細(xì)管法)［7］

健康雄性昆明小鼠80只，隨機(jī)分成8組，每組10只小鼠，分別為:NW1中、高、低濃度各1組，NW2中、高、低濃度各1組，生理鹽水組和阿司匹林對(duì)照組。每天固定時(shí)間給藥，NW1和NW2中高低給藥劑量分別為 10、20、40 mg/kg.d，阿司匹林 20 mg/kg.d。連續(xù)灌胃給藥7 d后，于末次灌胃給藥1 h后將毛細(xì)管(內(nèi)徑1.0 mm，長(zhǎng)120 mm)插入小鼠眼內(nèi)眥眼球后靜脈叢，自血液流入開(kāi)始計(jì)時(shí)，注滿后取出平放于桌面，每隔5 s折斷毛細(xì)管兩端約0.5 cm，并緩慢向左右拉開(kāi)，直至凝血絲出現(xiàn)為止，所經(jīng)歷的時(shí)間即為凝血時(shí)間CT。

1.2.3.2 出血時(shí)間(bleeding tim，BT)測(cè)定(剪尾法)［7］

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥同上2.3.1，于末次灌胃給藥30 min后，以酒精摩擦小鼠尾部至血管擴(kuò)張，以剪刀在距離小鼠尾尖0.3 cm處剪斷，立即計(jì)時(shí)，每隔20 s用濾紙吸取血滴1次，直至血流停止(以濾紙吸至無(wú)血跡時(shí)為準(zhǔn))，記錄出血時(shí)間BT。

1.2.4 體外抗凝血活性

1.2.4.1 血漿凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)測(cè)定［8］

新西蘭兔正常喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前按新鮮靜脈血與0.109 M 檸檬酸鈉體積比為9∶1，預(yù)先加入0.109 M檸檬酸鈉溶液。選取兔子靜脈較粗較清晰的耳朵，修剪采血部位的毛，用酒精多次擦洗，消毒，并使血管擴(kuò)張充血。用刀片在血管上切一小口，讓血液自然流至預(yù)先裝有檸檬酸鈉管中，輕緩混勻，3000 rpm低溫離心15 min，收集上層液體，即為待測(cè)血漿，2 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取待測(cè)血漿0.1 mL，分別加入0.05 mL 濃度為 1.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL 的 NW1 和NW2，空白對(duì)照組加0.05 mL蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組加0.05 mL 1.0 mg/mL的阿司匹林，然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，記錄凝固時(shí)間，即為PT值。每組平行測(cè)定10次。

1.2.4.2 血漿凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)測(cè)定［8］

血漿制備方法和實(shí)驗(yàn)組組別設(shè)置及濃度設(shè)置同2.4.1，然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，記錄凝固時(shí)間，即為TT值。每組平行測(cè)定10次。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS、EXECL進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，組間用t檢驗(yàn)與LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果表明(表1)，NW1和NW2的總酚含量相近，以提取物干粉計(jì)分別為2.4和2.2 mg GA/g，以海藻干基計(jì)分別為0.324 mg GA/g，以干粉質(zhì)量計(jì)提取率分別為13.51%和14.06%。

表1 總酚含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Total phenolic content of extractive from S.naozhouense

2.2 體內(nèi)抗凝血活性

2.2.1 硇洲馬尾藻褐藻多酚對(duì)CT的影響

表2數(shù)據(jù)顯示，與生理鹽水組相比，不同劑量NW1和NW2組的CT均有不同程度的延長(zhǎng)，且差異性顯著。其中 NW1中劑量(20.0 mg/kg.d)對(duì) CT的作用最顯著，為133.47 s，比生理鹽水組延長(zhǎng)了84.78%，隨著劑量的增加，CT有所下降，說(shuō)明NW1對(duì)CT的作用存在一個(gè)最佳劑量，濃度太高反而效果降低，這與魏玉西等［9］報(bào)道的鼠尾藻多酚的抗凝血作用相似。NW2高劑量組的CT相對(duì)較長(zhǎng)。總的來(lái)說(shuō)，低中高劑量的NW2對(duì)CT的作用沒(méi)有呈現(xiàn)出劑量與效果的明顯規(guī)律。

2.2.2 硇洲馬尾藻褐藻多酚對(duì)BT的影響

BT測(cè)定結(jié)果表明(表2)，與生理鹽水組對(duì)比，NW1組中高低劑量均能顯著延長(zhǎng)BT，其中低劑量和高劑量的延長(zhǎng)效果優(yōu)于中劑量，最多延長(zhǎng)了82.96%;NW2組不同劑量對(duì)BT的延長(zhǎng)作用極為顯著，均延長(zhǎng)了一倍以上，高劑量比生理鹽水組延長(zhǎng)近1.6倍，比阿司匹林組延長(zhǎng)了1.1倍?？傮w來(lái)說(shuō)，NW2對(duì)BT的作用強(qiáng)于NW1。

表2 硇洲馬尾藻多酚對(duì)CT和BT的影響(n=10)Table 2 Effects of phlorotannins from S.naozhouense on CT and BT(n=10)

2.3 體外抗凝血活性

2.3.1 硇洲馬尾藻褐藻多酚對(duì)PT的影響

表中數(shù)據(jù)顯示(表3)，NW1能顯著延長(zhǎng)PT，并表現(xiàn)出劑量時(shí)間依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為15 mg/mL時(shí)，PT為21.24 s，比對(duì)照延長(zhǎng)了63.38%，顯著高于阿司匹林組;NW2在低濃度時(shí)表現(xiàn)出較低的PT延長(zhǎng)活性，和生理鹽水組相比，沒(méi)有顯著性差異，隨著濃度的增加，NW2反而表現(xiàn)出顯著的縮短PT作用。

表3 硇洲馬尾藻多酚對(duì)PT和TT的影響(n=10)Table 3 Effects of phlorotannins from S.naozhouense on PT and TT(n=10)

2.3.2 硇洲馬尾藻褐藻多酚對(duì)TT的影響

從表3可看出，NW1對(duì)TT的延長(zhǎng)作用極為顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，15 mg/mL的濃度組比生理鹽水組延長(zhǎng)了近4倍(生理鹽水組的TT值在正常參考值范圍內(nèi))，遠(yuǎn)高于阿司匹林組。NW2在低濃度時(shí)，有一定的劑量依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，TT不再增加，5.0～15 mg/mL范圍內(nèi)NW2對(duì)TT的作用沒(méi)有顯著差異性。對(duì)比NW1和NW2對(duì)TT的效果可以看出，NW1的作用更加顯著，這一點(diǎn)與兩者對(duì)PT的作用相似。表中數(shù)據(jù)還說(shuō)明，陰性對(duì)照組的 PT(13.00±1.26s)和TT(14.00±0.85 s)測(cè)定結(jié)果分別在正常參考值10.7-14.3s和10.0 ～18.0 s范圍內(nèi)，說(shuō)明新鮮血漿的制備符合試劑盒的測(cè)定要求。

3 討論

褐藻多酚是海藻中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、降血脂等多種活性。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)硇洲馬尾藻褐藻多酚的抗凝血作用進(jìn)行了初步探討。

凝血過(guò)程是一種復(fù)雜的模式，包括內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑，兩者之間可以相互活化，并最終匯總于凝血酶形成和纖維蛋白形成的共同途徑。不同的抗凝血藥物作用的途徑不同，表現(xiàn)出的相應(yīng)機(jī)制也不同。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硇洲馬尾藻褐藻多酚NW1和NW2對(duì)CT和BT均有顯著延長(zhǎng)作用，但兩者的作用不同，分子量相對(duì)大的NW1對(duì)CT的效果優(yōu)于分子量相對(duì)小的NW2，魏玉西等［9］報(bào)道的結(jié)果與此類似。NW2對(duì)BT的延長(zhǎng)效果顯著高于NW1。由于CT是內(nèi)源性凝血途徑因子，而B(niǎo)T更多受血小板和毛細(xì)血管的影響，受凝血因子的影響相對(duì)較少，NW2主要為小分子量提取物，其中所含的成分相對(duì)更為復(fù)雜。因此，NW1和NW2產(chǎn)生的作用效果不同是正?，F(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中采用的阿司匹林劑量與魏玉西等和丁麗等的研究一致［9，10］，但對(duì)CT的延長(zhǎng)效果不顯著，他們的研究結(jié)果表明20 mg/kg.d的阿司匹林給藥劑量對(duì)小鼠具有顯著延長(zhǎng)CT作用，可能與所使用的阿司匹林生產(chǎn)廠家不同有關(guān)，也有相關(guān)報(bào)道采用100 mg/kg.d高劑量的阿司匹林作為陽(yáng)性對(duì)照。體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了硇洲馬尾藻褐藻多酚對(duì)PT和TT的作用，其中PT反映的是外源性凝血途徑，TT反映的是共同凝血途徑。

從以上結(jié)果可以看出，NW1對(duì)分別代表內(nèi)源和外源的CT和PT均有顯著延長(zhǎng)作用，對(duì)BT和代表共同途徑的TT也有顯著延長(zhǎng)作用，是比較全面的抗凝血物質(zhì)，而NW2對(duì)外源凝血途徑(PT)不起作用甚至起相反作用，對(duì)內(nèi)源性凝血途徑(CT)和共同途徑(TT)有一定作用，對(duì)BT作用顯著。推測(cè)相對(duì)分子量較大的NW1的抗凝血作用可能更多的與凝血途徑因子相關(guān)。如抗凝血藥物肝素也有類似的現(xiàn)象，肝素的抗凝血因子IIa活性與其分子量有關(guān)，分子量在5400D以上才具有抗IIa活性［11］，并隨分子量增加活性升高;NW2可能更多的作用于其他方面。兩者的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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