黃清松,李紅枝,鄭 敏

(廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院,廣州 510006)

小細(xì)胞肺癌是一種惡性程度很高的腫瘤,其特點(diǎn)是生長迅速,早期容易全身轉(zhuǎn)移,發(fā)病率較高,流行病學(xué)[1]調(diào)查顯示,小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的12%～15%。目前,臨床上多采用化療加放療相結(jié)合的方法進(jìn)行治療,但用此法治療其毒副作用大,患者難以堅(jiān)持。因此,尋找療效好而毒副作用低的藥物是目前腫瘤治療學(xué)方面的主要方向之一。

近年來,有研究[2-3]表明,厚樸根莖皮中的主要有效成分和厚樸酚,對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有比較明顯的抑制作用。研究和厚樸酚對(duì)某些腫瘤細(xì)胞的作用,例如人肺小細(xì)胞肺癌N446,探討和厚樸酚對(duì)人肺小細(xì)胞肺癌N446 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響,可為和厚樸酚在臨床上應(yīng)用于治療人肺小細(xì)胞肺癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 和厚樸酚,西安天一生物技術(shù)有限公司提供,產(chǎn)品批號(hào):20110113,純度＞99%)。人肺癌細(xì)胞株N446 細(xì)胞,中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。RPMI 1640 培養(yǎng)基(GIBCO,USA,每L 含L-谷氨酰胺0.33 mg、10%小牛血清,鏈霉素100 U、青霉素100 U、pH 7.4);胰蛋白酶(MERCK,USA);分析純H2O2(鎮(zhèn)江市化學(xué)試劑廠,批號(hào):20110311);四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Sigma 公司)、二甲基亞砜(DMSO)和小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司提供),Annexin-V-FITC(PI)雙染色試劑(上海美季生物技術(shù)有限公司提供)。用二甲基亞砜(DMSO)將和厚樸酚溶解后,再用0.22 μm 尼龍濾膜過濾除菌得到母液,其濃度為100 mg/mL,放入冰箱-20℃冷凍避光保存,臨用前以RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋至所需濃度,其中的DMSO 濃度≤0.1%。流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液RPMI 1640:pH=7.4,小牛血清含量為10%。人肺小細(xì)胞癌N446 細(xì)胞在RPMI 1640 中進(jìn)行培養(yǎng)(條件:37℃、5%CO2的孵育箱)。每隔48 h 換1 次液,以1∶5 的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 N446 細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長期的N446 細(xì)胞,以RPMI 1640 培養(yǎng)液配制成1×105/mL 細(xì)胞懸液,每孔200 μL 接種于96 孔板上培養(yǎng)24 h,細(xì)胞貼壁后吸除培養(yǎng)液。1)實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入200 μL不同濃度的和厚樸酚(終質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)。2)對(duì)照組加等量不含和厚樸酚的RPMI 1640 培養(yǎng)液。每組分別設(shè)有6 個(gè)復(fù)孔,按照上述常規(guī)培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)24、48、72、96 h 后再進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)后再培養(yǎng)4 h 后,吸除上清液再每孔加150 μL DMSO,振蕩10 min,將酶標(biāo)儀測調(diào)至492 nm 處測吸光度(A)值。3)采用MTT 法檢測,細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)組A 值)/對(duì)照組A 值×100%。

1.2.3 凋亡率的檢測 用RPMI 1640 培養(yǎng)液將對(duì)數(shù)生長期N446 細(xì)胞制成1×106/mL 的細(xì)胞懸液,每孔1 mL接種于24 孔板上后再培養(yǎng)24 h 后吸去原來的培養(yǎng)液。1)實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入1 mL不同濃度的和厚樸酚(濃度分別為5、10、20 μg/mL)。2)對(duì)照組加入等量的RPMI 1640 培養(yǎng)液。每組均為3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后離心收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次,用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)為1×106/mL 后,取5 mL 至培養(yǎng)管內(nèi),加入Annexin-V-FITC 液5 μL、PI 液5 μL,置于冰箱內(nèi)4℃避光反應(yīng)30 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對(duì)N446 細(xì)胞增殖的影響 見表1。

表1 和厚樸酚對(duì)N446 細(xì)胞增殖的影響(吸光度,)%

表1 和厚樸酚對(duì)N446 細(xì)胞增殖的影響(吸光度,)%

注:與對(duì)照組比較,#P ＜0.05,##P ＜0.01。

2.2 不同和厚樸酚質(zhì)量濃度對(duì)N446 細(xì)胞凋亡率的影響 見表2。

表2 不同和厚樸酚質(zhì)量濃度對(duì)N446 凋亡率的影響(n=6)

3 討論

厚樸為木蘭科植物,其枝根皮可提取生物活性物質(zhì)即和厚樸酚,具有多種藥理作用[2-3,11-12],尤其是在抗腫瘤方面的作用,由于其有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化、抑制腫瘤內(nèi)新生血管的生長和抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等多靶點(diǎn)、多途徑的抗腫瘤效應(yīng),加上其毒副作用小而倍受國內(nèi)外關(guān)注。國外研究[4-5]顯示,和厚樸酚單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。國內(nèi)研究[6-10]顯示,厚樸酚均具有明顯抑制癌瘤細(xì)胞的增長和誘導(dǎo)其凋亡的作用,且其引起抑制腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制與使癌瘤細(xì)胞阻滯于G1 期有關(guān),從而使細(xì)胞周期失控,導(dǎo)致細(xì)胞增殖停止,發(fā)生細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示,和厚樸酚對(duì)人小細(xì)胞肺癌N446細(xì)胞具有明顯的抑制作用和誘導(dǎo)其凋亡的作用,從而提示,和厚樸酚對(duì)臨床上用于治療小細(xì)胞肺癌具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究只對(duì)和厚樸酚對(duì)人小細(xì)胞肺癌N446 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響作了一些初步的探討,但對(duì)和厚樸酚對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞作用的具體的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入的研究。

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