付紅蕾，李 彥，蔣 磊，莊燕飛，常維山

（1.青島市飼料獸藥檢測(cè)站，山東青島 266071；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)系，山東泰安 271018）

牛奶作為日常飲食必需品早已經(jīng)進(jìn)入人們的日常生活，但是牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，是天然的培養(yǎng)基，極易腐敗變質(zhì)[1]。引起牛奶腐敗變質(zhì)的原因很多，商品化的牛奶雖經(jīng)過(guò)巴氏消毒，但是不能殺滅所有的微生物

[2-3]，一些嗜熱性的芽孢桿菌得以存活，最終成為引起牛奶變質(zhì)的一項(xiàng)原因。本試驗(yàn)通過(guò)分離培養(yǎng)，顯微鏡檢，初步推測(cè)牛奶中的嗜熱性芽孢桿菌多數(shù)為枯草芽孢桿菌，并用平板菌落計(jì)數(shù)法[4-5]對(duì)乳樣進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)。本試驗(yàn)還對(duì)不同稀釋濃度煮沸牛乳對(duì)高壓滅菌牛乳造成腐敗進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證經(jīng)煮沸過(guò)的牛乳依然可以造成高壓滅菌牛乳腐敗。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 牛乳及培養(yǎng)基

牛乳：取自某品牌純?nèi)橹破?；LB培養(yǎng)基：蛋白胨 2 g，酵母浸出物 1 g，NaCl 2 g，去離子水200 mL。

1.1.2 主要儀器和試劑

顯微鏡，電子天平，37 ℃培養(yǎng)箱，水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳樣的采集

試驗(yàn)用乳取自山東某品牌純?nèi)橹破?，該牛乳已?jīng)巴氏消毒處理。試驗(yàn)中一組牛乳再經(jīng)過(guò)80 ℃10 min，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，為乳樣1；另一組牛乳經(jīng)高溫濕熱滅菌處理，為乳樣2。試驗(yàn)均在超凈臺(tái)中進(jìn)行，以免污染。

1.2.2 乳樣內(nèi)細(xì)菌的分離和染色

1.2.2.1 細(xì)菌的分離

取80 ℃處理過(guò)的乳樣1，在LB板上劃線，然后37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2.2 細(xì)菌的染色取培養(yǎng)出的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，然后進(jìn)行鏡檢。

1.2.3 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定（平板菌落計(jì)數(shù)法）

1.2.3.1 乳樣的稀釋

取六只試管，依次編號(hào)為1、2、3、4、5、6，然后每只試管加入9 mL生理鹽水滅菌待用。然后取1 mL奶樣加入到1號(hào)管，搖勻。然后另取一支移液管，從1號(hào)管中取1 mL乳樣加入2號(hào)管中，依此類推一直稀釋到6號(hào)管。

1.2.3.2 樣品稀釋與接種

首先倒平板，在超凈臺(tái)中吹干平皿上的水，待凝固好之后進(jìn)行平板涂布，用移液器分別從1、2、3、4、5、6號(hào)試管中取出25 μL樣品滴在平皿中央。

1.2.3.3 平板培養(yǎng)

靜置待乳樣吸收后將六塊平皿倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，分別在8、9、10、11、12 h的時(shí)候計(jì)數(shù)。

1.2.3.4 菌落計(jì)數(shù)

分別在8～12 h每隔1 h進(jìn)行一次計(jì)數(shù)，細(xì)菌總數(shù)=菌落數(shù)量×稀釋倍數(shù)。

1.2.4 不同稀釋濃度乳樣對(duì)牛乳腐敗的測(cè)定

1.2.4.1 乳樣的準(zhǔn)備

由1.2.1中，取出乳樣2，試管分別編號(hào)A、B、C、D、E、F，然后依次抽取1～6號(hào)樣中1 mL加入到A～F號(hào)試管。整個(gè)操作過(guò)程都必須在超凈臺(tái)中完成。

1.2.4.2 樣品的培養(yǎng)

將六只試管放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔段時(shí)間進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳樣1 LB平板劃線分離結(jié)果

經(jīng)平板劃線培養(yǎng)12 h，平板上長(zhǎng)出兩種菌落，一種為形狀不規(guī)則的菌落，為半透明的奶油色，干燥，稱為細(xì)菌1。另一種表面濕潤(rùn)，稱為細(xì)菌2。兩種菌落的比例大約為7:1，第一種占多數(shù)。

2.2 所分離細(xì)菌革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果

通過(guò)圖1可以看出此菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，為桿菌。通過(guò)圖2可以看出此菌同樣為革蘭氏陽(yáng)性菌，為球桿菌。

2.3 乳樣1中的細(xì)菌總數(shù)

進(jìn)行平板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，稀釋10倍的平板8 h時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)成一個(gè)大的菌苔取消計(jì)數(shù)，8～12 h每隔1 h計(jì)數(shù)一次，結(jié)果顯示計(jì)數(shù)差別并不大，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由表1可以得出，乳樣1中細(xì)菌總數(shù)應(yīng)該在1×106這個(gè)數(shù)量級(jí)上。

2.4 不同稀釋濃度乳樣1對(duì)牛乳（乳樣2）腐敗的測(cè)定結(jié)果

表1 不同稀釋度下乳樣中的細(xì)菌總數(shù)

37 ℃培養(yǎng)36 h候1，2號(hào)管出現(xiàn)明顯的變質(zhì)現(xiàn)象，3～6號(hào)管沒(méi)有明顯的變化。

3 討論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們由菌落的形態(tài)，鏡檢結(jié)果，推測(cè)細(xì)菌1為嗜熱枯草芽孢桿菌。對(duì)煮沸的牛乳乳樣進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)嗜熱芽孢桿菌的每毫升總數(shù)達(dá)到106這個(gè)數(shù)量級(jí)，而且將細(xì)菌1接種高壓滅過(guò)菌的乳樣，在37 ℃情況下36小時(shí)就可以使牛奶變質(zhì)。所以可以證明普通商品化的牛乳雖然經(jīng)過(guò)了巴氏消毒法，但是其并不能殺滅牛乳里面的所有的微生物。如嗜熱芽孢桿菌就很難殺死，其可以引起滅菌牛乳的腐敗。這也證明了常溫下牛奶的保質(zhì)期較短，所以商品化的純牛奶也要盡量保存在低溫環(huán)境中。

牛乳中存在的枯草芽孢桿菌很有可能就是被奶牛的日常飼料所污染的[6]。此外針對(duì)細(xì)菌2是什么菌仍值得研究。細(xì)菌1可以引起牛乳的腐敗，那么是不是有某種殺菌方法可以殺滅此種細(xì)菌，從而延長(zhǎng)商品牛奶的保質(zhì)期，值得繼續(xù)研究探索。

[1]麥志杰，徐海濤，趙靜，等.檢測(cè)牛奶變質(zhì)的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2011，39（3）：24-25.

[2]韋同.消毒乳與超高溫滅菌乳的加工工藝和特性的比較[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2004， 20（3）：128-129.

[3]孫凱，呂禮良，楊瑾，等.鮮奶的檢測(cè)與消毒[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2007，09（28）：57-58.

[4]楊玉民，劉旭昊，唐琳，等.伊河河水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)的檢測(cè)研究[J].寧夏農(nóng)林科技，2011，52（7）：92-93.

[5]周德慶.微生物實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：高等教育出版社，2006：320-327.

[6]胡紅蓮，張博，高民.枯草芽孢桿菌型微生態(tài)制劑在奶牛日糧中應(yīng)用效果試驗(yàn)[J].飼料工業(yè)，2011，32（18）：52-55.