倪夢麗，楊 冰，王春德 ，陳穎，孫善華

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院， 山東青島 266109；2.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266001；3.青島機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266108；4.黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江黑河 164300）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來水產(chǎn)品包括貝類產(chǎn)品的進(jìn)出口業(yè)務(wù)大增，其中的鮮活貝類主要經(jīng)過機(jī)場口岸進(jìn)出口。進(jìn)出口的鮮活貝類的用途大部分是食用，少部分為種用。鮮活貝類具有易于死亡和腐敗變質(zhì)的特點(diǎn)，這就要求建立簡便、快速的病原生物的檢測方法，以利于貨物快速通關(guān)放行。

貝類中的主要病害生物包括病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物等，其中副溶血弧菌與沙門氏菌是最常見的主要貝類病原。副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，在富含浮游生物、微粒和幾丁質(zhì)的環(huán)境中能較好生長，廣泛存在于多種水產(chǎn)品中[1]。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌，是常見的人畜共患的腸道致病菌。其廣泛分布于自然界中，對人類和動(dòng)物健康具有極大危害[2]。副溶血弧菌、沙門氏菌等貝類病原生物能夠引起嚴(yán)重的食物中毒、感染、動(dòng)物性傳播疾病，它們在水產(chǎn)品中的存在為水產(chǎn)品食品安全帶來極大的隱患。因此對于貝類中該兩種細(xì)菌能夠快速、準(zhǔn)確、簡便的進(jìn)行檢測對于食品安全具有重要意義[3、4]。

目前，傳統(tǒng)的檢測方法大都通過病原培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、分離鑒定等程序。這些程序檢驗(yàn)過程復(fù)雜、所需儀器繁多、工作量大、周期長，難以達(dá)到快速簡便的要求，無法形成標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化的檢測體系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的貝類病原生物的核苷酸序列被發(fā)表出來。利用這些序列信息和PCR技術(shù)，為準(zhǔn)確、快速、低成本地檢測進(jìn)出口貝類中的病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物等病原生物提供了可能。實(shí)際上，所有存在于宿主體內(nèi)的病原生物的DNA/RNA都可以用常用的DNA/RNA提取方法同宿主的DNA/RNA一起提取出來，且其DNA/RNA的拷貝數(shù)與其在宿主體內(nèi)的含量成正比。因此，只要根據(jù)病原生物的基因序列設(shè)計(jì)合適的引物，就能夠用基于熒光定量PCR的技術(shù)特異地定量檢測出來。

熒光定量PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、直觀[5]等優(yōu)勢，已在貝類病原檢測中得到廣泛應(yīng)用。本研究通過設(shè)計(jì)退火溫度相近的引物，將多種病原生物引物在同一個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測，使得檢驗(yàn)流程可以標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，以達(dá)到迅速、直觀、準(zhǔn)確、簡便、低成本的檢驗(yàn)鮮活貝類中的病原生物的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

用于本試驗(yàn)的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus As1.1997）、沙門氏菌（Salmonella As1.1552）均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；燦爛弧菌（Vibrio splendidus）、費(fèi)氏弧菌（vibrio fi scheri）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）均由黃海水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

Taq酶、E.coli competent cells DH5α、SYBR Premix Ex Taq均購自寶生物（大連）生物工程公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；Ins TAcolne PCR cloning kit購自富酶泰斯生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光引物設(shè)計(jì)與合成

副溶血弧菌熒光引物根據(jù)gyrB基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，沙門氏菌熒光引物根據(jù)fi mY基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，這兩種基因都有種內(nèi)的高度保守性和種間的高度特異性，引物序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 所用引物序列

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

對副溶血弧菌gyrB基因、沙門氏菌fi mY基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、純化含有目的片段的PCR產(chǎn)物，將目的片段連接到pTZ57R/T載體中。將制備好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行回收、純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，利用紫外分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒的濃度并計(jì)算出拷貝數(shù)。

1.2.3 熒光PCR的反應(yīng)條件

擴(kuò)增反應(yīng)在Roche LightCycler 480 Ⅱ型熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0μL，10μM 的gyrB、fi mY上 下 游 引 物 各 0.4μL，DNA模 板2.0μL，ddH2O 7.2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火并延伸20s，45個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號(hào)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將構(gòu)建好的兩種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別作為副溶血弧菌和沙門氏菌定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用ddH2O對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍比梯度稀釋，采用建立的體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣品，以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。檢測各濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的Ct值，建立質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 特異性檢測

以1.2.3建立的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，以燦爛弧菌（Vibrio splendidus）、費(fèi)氏弧菌（Vibrio fi scheri）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）等貝類常見病原菌作為陰性對照菌株，以ddH2O作為無模板空白對照，進(jìn)行熒光定量PCR特異性檢測。

1.2.6 重復(fù)性檢測

分別取副溶血弧菌和沙門氏菌某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在一次試驗(yàn)中重復(fù)20次，觀察Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，以此來初步檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性。

1.2.7 檢測方法的初步應(yīng)用

分別取經(jīng)傳統(tǒng)方法檢測證實(shí)含副溶血弧菌和沙門氏菌的扇貝樣品，取出全部組織。稱取30g樣品勻漿，以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。以提取的細(xì)菌DNA為模板，按照1.2.3建立的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

圖1 FQ-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖1為熒光定量PCR產(chǎn)物電泳圖片。副溶血弧菌熒光引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小介于250bp與500bp之間，沙門氏菌熒光引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小介于100bp與250bp之間，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結(jié)果證明擴(kuò)增片段與序列完全相符，說明設(shè)計(jì)的熒光引物能夠擴(kuò)增出特異的電泳條帶。

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定后，確定副溶血弧菌重組質(zhì)粒濃度為 47.67ng/μL，OD260/OD280為1.824，沙門氏菌重組質(zhì)粒濃度為60 ng/μL，OD260/OD280為1.856，證明該兩種重組質(zhì)粒的純度都較高。根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算出每μL重組質(zhì)粒的拷貝量，副溶血弧菌重組質(zhì)粒為1.53×1011拷貝/μL，沙門氏菌重組質(zhì)粒為4.89×1011拷貝/μL。

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.53×105～1.53×109拷貝/μL之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，斜率為3.850，截距為38.012，得出質(zhì)?？截悢?shù)（X）與Ct值之間的線性方程為：Ct=-3.850lgX+38.012（圖2）。

圖2 副溶血弧菌質(zhì)?？截悢?shù)與最小循環(huán)數(shù)（Ct）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線在4.89×106～4.89×1010copy/μL之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，斜率為3.492，截距為31.397，得出質(zhì)?？截悢?shù)（X）與Ct值之間的線性方程為：Ct=-3.492lgX+31.397（圖3）。

圖3 沙門氏菌質(zhì)?？截悢?shù)與最小循環(huán)數(shù)（ Ct ）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 定量熔解曲線分析

從熔解曲線（圖4、圖5）可以看出，副溶血弧菌和沙門氏菌均呈現(xiàn)出典型的熔解峰，擴(kuò)增目的基因的熔點(diǎn)值Tm分別為85.46℃和85.08℃，檢測結(jié)果為陽性。陰性對照未出現(xiàn)特異性熔解峰，檢測結(jié)果為陰性。說明該兩種熒光引物的特異性均較強(qiáng)，無引物二聚體產(chǎn)生。

圖4 副溶血弧菌熔解曲線

圖5 沙門氏菌熔解曲線

2.4 特異性檢驗(yàn)

以本研究建立的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件對燦爛弧菌（Vibrio splendidus）、費(fèi)氏弧菌（vibrio fischeri）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）4株陰性對照菌株和ddH2O進(jìn)行熒光定量檢測，均未產(chǎn)生S型擴(kuò)增曲線，Ct值無法讀取，為陰性。該結(jié)果與傳統(tǒng)生化檢測方法結(jié)果一致。

圖6 副溶血弧菌熒光定量PCR20次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性檢驗(yàn)

為了初步檢驗(yàn)方法的重復(fù)性，本研究分別取副溶血弧菌和沙門氏菌某一濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在一次試驗(yàn)中重復(fù)20次。結(jié)果表明，副溶血弧菌重組質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線在閾值線附近基本上重合（圖6），Ct值平均讀數(shù)為27.47，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.31，變異系數(shù)為1.15%。沙門氏菌重組質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線在閾值線附近也是基本上重合的（圖7），Ct值平均讀數(shù)為23.79，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.32，變異系數(shù)為1.34%。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本研究所建立的副溶血弧菌和沙門氏菌雙重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法重復(fù)性好。

圖7 沙門氏菌熒光定量PCR20次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.6 檢測方法的實(shí)測檢驗(yàn)

對扇貝樣品的實(shí)測結(jié)果，測得副溶血弧菌陽性扇貝樣品Ct值為22.37，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得其拷貝量應(yīng)為1.53×106拷貝/μL，與MPN培養(yǎng)檢測法測得1.49×106拷貝/μL接近；測得沙門氏菌陽性扇貝樣品Ct值為20.97，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得其拷貝量應(yīng)為4.89×106拷貝/μL，與MPN培養(yǎng)檢測法測得4.81×106拷貝/μL接近，說明該研究方法可以滿足水產(chǎn)品中副溶血弧菌和沙門氏菌的快速檢測。

3 討論

貝類中存在的病原生物種類繁多，國際上針對不同類別的病原生物的檢測通常需要用不同的方法。例如病毒和細(xì)菌的檢測通常需要通過培養(yǎng)的方法，而原生動(dòng)物的檢測很多通過電鏡觀察、組織病理學(xué)方法和基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法，需要分別建立不同的方法和實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，時(shí)間長，因此無法做到快速檢測和檢測標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化的要求。隨著PCR技術(shù)的問世，基于該技術(shù)的檢測方法逐漸被應(yīng)用到病原生物的檢測上，例如早在上世紀(jì)九十年代初Ward et al.[6]即開始用PCR方法檢測節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒。迄今為止PCR技術(shù)在國際上已經(jīng)成為主要的水產(chǎn)動(dòng)物中病原生物檢測方法。

在貝類中，PCR方法已廣泛用于各種病原的檢測。

雖然所有基于PCR技術(shù)的基本原理相同，但在PCR產(chǎn)物檢測技術(shù)上不斷改進(jìn)。早期的PCR產(chǎn)物檢測方法主要是通過凝膠電泳根據(jù)產(chǎn)物的大小和測序來判定所擴(kuò)增的是否為預(yù)期的產(chǎn)物，以后通過DNA雜交技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)了產(chǎn)物的檢測方法，例如可以用點(diǎn)雜交和原位雜交來顯示與標(biāo)記的DNA探針雜交的PCR產(chǎn)物，顯色的方法則主要包括染色法和熒光法，這些方法既可以用來定性研究也可以定量研究病原生物的存在。隨著熒光PCR方法的出現(xiàn)，人們可以直接將熒光染料摻入到PCR產(chǎn)物中，使實(shí)時(shí)定量檢測PCR產(chǎn)物成為可能。

近年來，熒光定量PCR技術(shù)已越來越多的應(yīng)用于致病菌的檢測中[7-9]，我國用PCR技術(shù)檢測水產(chǎn)動(dòng)物中病原生物始于90年代中后期，在貝類中已用于檢測甲肝病毒[10]、輪狀病毒[11]和諾瓦克病毒[12]和櫛孔扇貝中的急性壞死病毒[13]等病毒類病原體，副溶血弧菌[14]等細(xì)菌性病原體，以及單孢子蟲、派琴蟲、馬爾太蟲[15]等原生動(dòng)物類病原體。以往多為單一PCR，每次只能檢測一種病原生物，若要同時(shí)檢測貝類中的主要病原生物則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用于水產(chǎn)品尤其是鮮活貝類快速通關(guān)的要求。目前，國內(nèi)針對貝類主要病原副溶血弧菌和沙門氏菌同時(shí)進(jìn)行熒光定量檢測方法的研究還很少，本研究采用了根據(jù)副溶血弧菌gyrB基因、沙門氏菌fi mY基因設(shè)計(jì)的特異熒光引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，在不同的DNA濃度中，副溶血弧菌gyrB基因和沙門氏菌fi mY擴(kuò)增穩(wěn)定。

但是，該方法也存在一定的局限性。當(dāng)樣本中細(xì)菌拷貝量很低時(shí)，雙重?zé)晒舛縋CR檢測雖有擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，但不易明確判斷。因此，在基線、閾值一定時(shí)，對于Ct值大于30的樣品，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或采用其他傳統(tǒng)方法予以確證。

該方法操作簡便快捷，能在1.5h內(nèi)同時(shí)完成貝類中副溶血弧菌和沙門氏菌的檢測，根據(jù)本文的結(jié)果，未來可搜集所有已經(jīng)發(fā)表的貝類中病原生物核酸序列，設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化產(chǎn)物檢測手段，建立貝類主要病原檢測數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫不僅可以提供高通量的、快捷、簡便、準(zhǔn)確的貝類病原生物檢測方法，同時(shí)檢測不同類別的病原生物，達(dá)到快速檢測保證水產(chǎn)品迅速通關(guān)的目的；還可為貝類重大疾病的預(yù)警預(yù)報(bào)和防治技術(shù)提供基礎(chǔ)材料。

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