鄭小龍，王 群，朱來華，鄧明俊，肖西志，梁成珠，姜 帆，于業(yè)鋒

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002）

馬媾疫（Dourine）是由錐蟲屬（Trypanosoma）的馬媾疫錐蟲（Trypanosoma equiperdum）寄生于馬屬動(dòng)物的生殖器官所引起一種寄生蟲性傳染病[1]。馬媾疫是唯一不以無脊椎動(dòng)物為媒介而直接傳播的錐蟲病[2]，主要通過病馬與健馬交配傳染[3]。

我國與俄羅斯、韓國、蒙古等國家簽訂的雙邊協(xié)議書中將馬媾疫列為進(jìn)出境馬屬動(dòng)物必檢疫病之一，也是OIE須申報(bào)疫病。目前，國內(nèi)該病的檢測主要通過血清學(xué)和病原學(xué)兩種方法。血清學(xué)方法包括ELISA[4-5]、間接免疫熒光[6]和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)[2]，國內(nèi)外尚未有成熟的商品化的ELISA和間接免疫熒光試劑盒，而補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作繁瑣，影響因素過多，結(jié)果判定比較困難；而病原學(xué)檢測國內(nèi)一直采用血涂片方法[3]，由于馬媾疫錐蟲主要存在于組織中，很少侵入血液[2]，因此該方法檢出率很低。

PCR檢測方法以其操作簡便、快速特異、靈敏度高等特點(diǎn)，展示出了優(yōu)越的應(yīng)用前景。Moser等[7]首先建立了PCR技術(shù)在錐蟲病上的檢測，克服了之前核酸雜交診斷法的敏感性受限制的不足。在我國，王云飛等[8]最早用PCR技術(shù)來診斷伊氏錐蟲病，而對于馬媾疫錐蟲PCR檢測方法的研究較少。本研究利用錐蟲基因組中存在的差異[9-10]，依據(jù)馬媾疫錐蟲大環(huán)kDNA基因的一段序列設(shè)計(jì)引物，建立了一種特異、快速的檢測馬媾疫錐蟲的PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株 馬 媾疫錐蟲基因組、伊氏錐蟲基因組和馬焦蟲基因組由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Taq DNA polymerase （5 U/μL）、dNTP（ 各 2.5 mmol/L）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）、DNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 登錄的馬媾疫錐蟲Maxicircle DNA 基因序列，選擇保守區(qū)域，利用DNAstar軟件設(shè)計(jì)一對PCR的引物。D1：5’-TGGGTTTATATCAGGTTCATTTAT-3’和D2：5’-CCCTAATAATCTCATCCGCAGT-3’，擴(kuò)增長度為395bp，由南京金斯瑞合成。

1.2 方法

1.2.1 馬媾疫錐蟲基因特異性保守片段的擴(kuò)增 以馬媾疫錐蟲基因組為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。反應(yīng)完畢，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。

1.2.2 PCR的靈敏性檢驗(yàn) 將馬媾疫錐蟲DNA于核酸蛋白檢測儀測定其含量，以2 ng/μL為起始濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋，6個(gè)梯度濃度分別為2 ng/μL、0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、2 pg/μL、0.2 pg/μL、20 fg/μL，然后同 1.2.1進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以檢測其敏感性。

1.2.3 PCR的特異性檢驗(yàn) 利用引物對馬媾疫錐蟲、伊氏錐蟲、馬焦蟲的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，以檢測其特異性。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測方法的建立

以馬媾疫錐蟲基因組為模板，以引物D1和D2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果能擴(kuò)增出與預(yù)期一致的特異性DNA片段（約395bp）（圖1）。進(jìn)一步切膠回收DNA測序，并進(jìn)行序列分析，確證兩條特異性引物間的序列為馬媾疫錐蟲kDNA片段序列。

2.2 PCR檢測方法的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

將馬媾疫錐蟲DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，用引物D1和D2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。6個(gè)濃度梯度的PCR結(jié)果顯示，本研究建立的PCR方法能夠檢 測 出 2 ng/μL、0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、2 pg/μL和0.2 pg/μL的馬媾疫錐蟲總DNA，最低可檢測到0.2 pg/μL DNA，具有較高的敏感性（圖2）。

圖2 PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn)結(jié)果

用引物D1和D2對馬媾疫錐蟲、馬伊氏錐蟲和馬焦蟲的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，馬媾疫錐蟲DNA樣本能夠擴(kuò)增出與預(yù)期大?。?95bp）相吻合的特異DNA條帶，而對馬伊氏錐蟲和馬焦蟲的核酸樣品均不能擴(kuò)增出特異性條帶，呈陰性反應(yīng)（圖3）。

3 討論

圖3 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

PCR技術(shù)是由美國Mullis K B等人于1985年建立，并在后來不斷發(fā)展并完善的一種人工體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)能快速、特異地在體外擴(kuò)增特定的DNA片斷，使之在短時(shí)間（數(shù)小時(shí)）內(nèi)特異地?cái)U(kuò)增數(shù)百萬倍。目前，該技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌、病毒病的研究和診斷。

錐蟲含動(dòng)基體目原蟲特有的非染色體動(dòng)基體DNA（kDNA），國際上首先發(fā)展的用于檢測錐蟲的分子探針，主要是以錐蟲動(dòng)基體DNA（即kDNA）為目標(biāo)。kDNA是由少數(shù)大環(huán)和大量微環(huán)組成的網(wǎng)狀分子。感染馬的錐蟲主要為馬媾疫錐蟲和馬伊氏錐蟲，而馬伊氏錐蟲的動(dòng)基體DNA缺乏大環(huán)而由微環(huán)組成，因此本文選擇動(dòng)基體DNA大環(huán)作為檢測和鑒定馬媾疫錐蟲的靶DNA，從而可以區(qū)分馬媾疫錐蟲和馬伊氏錐蟲。

本文通過對不同溫度PCR條件進(jìn)行摸索，最終確定了最佳退火溫度為56℃。本試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法對馬媾疫錐蟲DNA的最低檢測量為0.2pg/μL，靈敏度較高。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的PCR引物能夠擴(kuò)增出馬媾疫錐蟲395bp的目的片段，而對馬伊氏錐蟲和馬焦蟲均無擴(kuò)增產(chǎn)物，從而證明本實(shí)驗(yàn)具有良好的特異性。

本方法的建立為馬媾疫錐蟲的診斷又增加了一個(gè)重要的檢測手段，而且克服了傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出率低等缺點(diǎn)。該方法快速、敏感、特異，有著良好的應(yīng)用前景。

[1]王群，鄭小龍，朱來華，等.馬媾疫錐蟲SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（9）：724-727.

[2]World Organization for Animal Health （OIE）.Dourine [M]//Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.6thed Paris， France： OIE， 2008.

[3]王玉玲.馬媾疫微量補(bǔ)體結(jié)合的改良試驗(yàn)[J].中國動(dòng)物檢疫，2003， 20（6）：23-25.

[4]Wassall D A， Gregory R J F， Phipps L P.Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）for the serodiagnosis of dourine[J].Vet Parasitol.， 1991， 39（3/4）：233-239.

[5]Working Protocols， BGVV： ELISA on Dourine （1995）.Bundesinstitut fur Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterin?rmedizin （BgVV）.P.O.Box 33 00 13， D-14191 Berlin，Germany.

[6]MINISTRY OF AGRICULTURE， FISHERIES AND FOOD （1986）.A Manual of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques， 3rd ed.Her Majesty’s Stationery Office，London， UK.

[7]Moser D R，Cook C A，Ocks D E．Detection of Trypanosoma congolense and Trypanosoma brucei subspecies DNA ampli fi cation using polymerase chain reaction[J].Parasitology，1989， 99（1）： 57-56.

[8]王云飛， 周勇志， 淑梅.應(yīng)用PCR擴(kuò)增檢測伊氏錐蟲的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 1998，29（2）：168-173.

[9]Li Fengjun， Gasser R B， Lai Dehua， et al.PCR approach for the detection of Trypanosoma brucei and T.equiperdum and their differentiation from T.evansi based on maxicircle kinetoplast DNA[J].Mol Cell Probes，2007，21（1）：1-7.

[10]Claes F， Radwanska M， Urakawa T， et al.Variable surface gly-coprotein RoTat 1.2 PCR as a speci fi c diagnostic tool for thedetection of Trypanosoma evansi infections[J].Kinetoplastid Biol Dis，2004，3（1）：3.