邵紅霞，杜鐘珍，李 莉，吳 琦

肺癌是當(dāng)今世界各國最常見的惡性腫瘤之一，80%的肺癌患者在診斷后1年內(nèi)死亡，5年生存率為14%［1］。盡管近年來醫(yī)務(wù)工作者在肺癌的預(yù)防、早期診斷、早期治療、新化療藥物的發(fā)明及放、化療與手術(shù)相結(jié)合的綜合治療等手段上做了很大的努力，但目前肺癌的總體預(yù)后效果仍不理想。肺癌發(fā)病率和病死率居高不下，迫切期望人們突破傳統(tǒng)思維，尋求新的治療方法。光動(dòng)力學(xué)療法 (photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑和光產(chǎn)生的光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)治療腫瘤的一種非手術(shù)治療方法，此方法通過全身或局部應(yīng)用光敏劑后選擇性地吸收潴留于腫瘤組織內(nèi)，經(jīng)特定波長激光照射，產(chǎn)生光化學(xué)作用而殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究旨在探討發(fā)光二極管 (light－emitting diode，LED)作為PDT光源對(duì)裸鼠肺移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2 動(dòng)物 BALB/C nu/nu裸鼠15只，雄性，4～6周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 光敏劑與主要試劑 血卟啉衍生物類光敏劑photosan－3，細(xì)胞培養(yǎng)基，液態(tài)滅菌F12，Hyclone Inc;胎牛血清，胰蛋白酶，四甲偶氮唑鹽，二甲基亞砜，250 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，100 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，微孔濾膜。

1.1.4 主要設(shè)備 LED激光器;光功率計(jì):PM50，Thorlab，New Jersey;二氧化碳培養(yǎng)箱:D6450，德國Heraeus;倒置顯微鏡:德國Leica;微量加樣器:德國Eppendof;高速臺(tái)式離心機(jī):江蘇海門其林貝爾;2010MC型酶標(biāo)儀;渦旋振蕩器:日本東芝 SCR20BA;－20℃低溫冰箱 (BD－93):海爾;－80℃超低溫冰箱:美國Thermo Forma;防護(hù)眼鏡:Thorlab。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 F12培養(yǎng)基，10%小牛血清，含100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素雙抗，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)方法參照參考文獻(xiàn) ［2］介紹的方法進(jìn)行。

1.2.2 動(dòng)物移植瘤模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加含血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000 r/min離心10 min，取出后棄去上清液，加入培養(yǎng)基2 ml，吸管吹勻，取100 μl計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml，按每只小鼠0.2 ml注入右腋下皮下，每日開始用游標(biāo)卡尺測(cè)量，粗略估計(jì)腫瘤長徑 (a)與短徑 (b)，腫瘤體積 (V)=a×b2×0.5。待腫瘤體積長至50 mm3左右備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將15只4～6周齡BALB/C nu/nu雄性裸鼠隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組、單純激光照射組和LED－PDT治療組，各5只。

1.2.4 光敏劑配置 于實(shí)驗(yàn)前避光條件下在電子天平上稱少許顆粒狀photosan－3，使用PBS液 (pH 7.4)溶液配制成較高濃度工作液，過濾除菌后密封，黑紙包裹4℃避光保存使用，使用時(shí)用PBS液梯度稀釋成實(shí)驗(yàn)所需各種不同濃度。每次實(shí)驗(yàn)均臨時(shí)配制新鮮的光敏劑溶液。

1.2.5 避光方法 配置與加入光敏劑、照射時(shí)均需嚴(yán)格避光處理，光敏劑存放、配液均使用專用避光錫箔紙包裹;裸鼠在注射光敏劑藥物后要用黑布遮蓋鼠籠避光，照光時(shí)將鼠籠拿入暗室對(duì)裸鼠進(jìn)行PDT，治療后仍要用黑布遮蓋鼠籠。

1.2.6 激光器光源的準(zhǔn)備 將光功率計(jì)表頭平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，每次照射前調(diào)整光斑大小超過腫瘤直徑，使用光功率計(jì)進(jìn)行光分布測(cè)量。

1.2.7 照射過程 荷瘤對(duì)照組不予任何治療;單純激光照射組不予光敏劑，用LED激光器將功率調(diào)至80 mW，照射腫瘤組織局部21 min，使能量密度達(dá)到約100 J/cm2;LED－PDT治療組按照20 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射photosan－3，避光5 h后，將LED激光器功率調(diào)至80 mW，在能量密度100 J/cm2條件下進(jìn)行腫瘤局部PDT。PDT后裸鼠仍避光7 d。

1.2.8 治療后處理 觀察腫瘤組織表面情況，7 d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腫瘤組織，甲醛溶液中固定，固定后進(jìn)行HE染色，觀察組織壞死情況。測(cè)量治療前后裸鼠腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以 ()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療前3組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。治療7 d后，3組腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);其中荷瘤對(duì)照組和單純激光照射組腫瘤體積均大于LED－PDT治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。治療后，荷瘤對(duì)照組、單純激光照射組腫瘤表面無明顯變化，病理顯示腫瘤組織無壞死 (見圖1);LED－PDT組見腫瘤表面壞死、結(jié)痂，鏡下見細(xì)胞壞死、崩解、細(xì)胞輪廓模糊(見圖2)。

表1 3組治療前后腫瘤體積比較(，mm3)Table 1 Comparison of tumor volume among 3 groups before and after treatment

表1 3組治療前后腫瘤體積比較(，mm3)Table 1 Comparison of tumor volume among 3 groups before and after treatment

5 497.79±50.55 561.61±49.45單純激光照射組 5 515.24±45.14 573.92±33.26 LED－PDT治療組組別 只數(shù) 治療前 治療后荷瘤對(duì)照組5 550.54±63.55 554.13±71.24

圖1 正常腫瘤組織，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，凋亡 (HE染色，×10)Figure 1 Normal tumor tissue，without cell structural damage，apoptosis

圖2 壞死腫瘤組織，細(xì)胞已溶解破壞，不能見到完整腫瘤細(xì)胞 (HE染色，×40)Figure 2 Necrotic tumor tissue，cells lysised，without intact tumor cells

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界對(duì)人類健康及生命危害最大的惡性腫瘤之一，目前手術(shù)、放化療仍是治療肺癌的首選方法。但是對(duì)于一部分心、肺功能較差或伴有其他系統(tǒng)疾病，不宜手術(shù)的早期肺癌患者，這些方法創(chuàng)傷或毒副作用較大，常難以接受;而對(duì)于晚期出現(xiàn)呼吸道堵塞癥狀的患者，上述方法不能多次應(yīng)用且無法有效控制堵塞癥狀，嚴(yán)重影響晚期肺癌患者的生活質(zhì)量［3－4］。PDT是隨著光纖技術(shù)、激光醫(yī)學(xué)和內(nèi)鏡技術(shù)發(fā)展而興起的一種治療惡性腫瘤的新方法［5］，已在實(shí)體腫瘤的臨床治療中被廣泛應(yīng)用。PDT通過光敏劑在惡性腫瘤組織與正常組織形成一定的濃度差時(shí)，給予腫瘤組織照射特定波長的光，光敏劑吸收光子的能量后，產(chǎn)生一系列氧化活性分子。這些氧化活性分子通過氧化作用攻擊腫瘤細(xì)胞使其死亡，達(dá)到治療目的。

目前認(rèn)為，PDT除了直接細(xì)胞殺傷機(jī)制，還可以通過以下兩種機(jī)制抗腫瘤生長［6］:(1)脈管損傷機(jī)制:使腫瘤血管阻塞;(2)免疫應(yīng)答機(jī)制:使腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、巨核細(xì)胞大量聚集。PDT已較多應(yīng)用于皮膚等淺表腫瘤，主要是因其便于照射治療的特點(diǎn)，近幾年發(fā)現(xiàn)PDT應(yīng)用于上消化道腫瘤亦可以達(dá)到治療效果［7－8］。并已有報(bào)道稱光動(dòng)力對(duì)上消化道腫瘤可以達(dá)到治愈效果［9］，這為腔內(nèi)腫瘤的早期無痛苦治愈及晚期姑息治療提供了新的方法。

本實(shí)驗(yàn)采用荷瘤裸鼠活體實(shí)驗(yàn)來觀察LED－PDT治療肺癌的療效，光敏劑照射組可見腫瘤組織表面變紅，治療后連續(xù)觀察可見腫瘤表面出現(xiàn)壞死，觀察7 d發(fā)現(xiàn)腫瘤生長速度與其他兩組相比明顯減慢，1周后腫瘤部位出現(xiàn)干燥、結(jié)痂、組織壞死。處死小鼠后，鏡下見細(xì)胞壞死、崩解、細(xì)胞輪廓模糊，而荷瘤對(duì)照組及單純照射組均無此變化。本實(shí)驗(yàn)通過荷瘤裸鼠活體實(shí)驗(yàn)說明，PDT對(duì)肺癌細(xì)胞有直接殺傷作用，為光動(dòng)力學(xué)在肺癌的臨床治療中的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

PDT與目前常用的外科手術(shù)、化療和放療相比，最大的優(yōu)點(diǎn)在于可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞損害小，并可與其他療法聯(lián)合使用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。在PDT治療過程中，激光光源良好的可控性更加強(qiáng)了PDT的選擇性，對(duì)腫瘤組織殺傷效應(yīng)強(qiáng)，對(duì)正常組織損傷小，同時(shí)穿透深度有限。本實(shí)驗(yàn)所用激光器以紅光LED作為激光光源，因?yàn)槠渚哂畜w積小、使用方便、使用壽命長、功率輸出穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。雖然作為照明設(shè)備，LED成本高于白熾燈，但是作為PDT光源，與其他激光器相比，LED材料具有較易獲得、堅(jiān)固耐用、壽命長的特點(diǎn)，可以大大降低治療成本［2］。LED光源最大優(yōu)勢(shì)在于輸出功率小，功率穩(wěn)定，為得到與大激光器相同的能量密度，LED需要更長照射時(shí)間，而此過程LED可以保證較穩(wěn)定的功率輸出。另外LED相對(duì)大激光器價(jià)格便宜，更適于推廣應(yīng)用［10］。可見，LED作為PDT光源具有更大的優(yōu)勢(shì)，更具發(fā)展前景。

1 陳首英，劉福林，龐志剛，等.肺癌病人5年生存率及生存因素分析 ［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)信息，2004，10(1):1－3.

2 Peloi LS，Soares RR，Biondo CE，et al.Photodynamic effect of light－emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blue ［J］.Boisci，2008，33(2):231 －237.

3 Cheung R，Solonenko M，Busch TM，et al.Correlation of in vivo photosensitizer fluorescence and photodynamic－therapy－induced depth of necrosis in a murine tumor model［J］.Journal of Biomedical Optics，2003，8(2):248－252.

4 雷亞春，張勇，劉滇生，等.卟啉及其配合物在分析化學(xué)中應(yīng)用進(jìn)展 ［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2003，20(4):479－485.

5 Allison RR，Bagnato VS，Sibata CH.Future of oncologic photodynamic therapy ［J］.Future Oncol，2010，6(6):929 －940.

6 Robertson CA，Evans DH，Abrahamse H.Photodynamic therapy(PDT):a short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT ［J］.J Photochem Photobiol B，2009，96(1):1－8.

7 林佳鈿，陳俊輝.光動(dòng)力療法在食管癌治療中的應(yīng)用 ［J］.中國腫瘤臨床與康復(fù)，2012，19(1):94－96.

8 章忠強(qiáng)，姚宏亮，文宇，等，光動(dòng)力技術(shù)治療胃癌的進(jìn)展與展望［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2012，21(4):289－293.

9 劉慧龍，李慧麗，賈曉燕，等.光動(dòng)力療法治愈上消化道癌5例的臨床分析［J］.中國激光學(xué)雜志，2013，22(2):93－96.

10 Attar N，Korkmaz Y.Effect of two light－emitting diode(LED)and one halogen curing light on the microleakage of class V flowable compositerestorations ［J］. J Contemp Dent Pract，2007，8(2):80－88.