李雅靜 王 晨

左卡尼汀對柔紅霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

李雅靜 王 晨

目的：觀察左卡尼汀注射液（Levocarnitine injection）對柔紅霉素（Daunorubicin，DNR）所致的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：將培養(yǎng)5d的新生Wister乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、DNR損傷組和左卡尼汀低、中、高劑量保護(hù)組，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：左卡尼汀各實(shí)驗(yàn)劑量均能顯著提高受損心肌細(xì)胞的存活率，抑制LDH釋放量，減少M(fèi)DA的生成，提高SOD活性。結(jié)論：左卡尼汀對柔紅霉素所致的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

左卡尼汀注射液 柔紅霉素 心肌細(xì)胞 心臟毒性

柔紅霉素（daunorubicin，DNR）屬于蒽環(huán)類抗癌藥，適用于治療急性粒細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病，包括慢性急變者，但由于DNR具有劑量累積的心肌毒性，使其臨床應(yīng)用受到限制［1-2］。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，臨床上常采用靜脈滴注左卡尼汀對其進(jìn)行預(yù)防［3-4］。左卡尼汀是脂肪酸代謝的必需輔助因子，是心肌細(xì)胞的主要能量來源，說明書中標(biāo)明其適用于慢性腎衰長期血透患者因繼發(fā)性肉堿缺乏產(chǎn)生的一系列并發(fā)癥狀，如心肌病、心律失常等。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)新生乳鼠心肌細(xì)胞復(fù)制DNR損傷模型，觀察不同劑量左卡尼汀對中毒心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 注射用鹽酸柔紅霉素（Pharmacia，規(guī)格：20 mg，批號：9F1004-A）、左卡尼汀注射液（常州蘭陵制藥有限公司，規(guī)格5 mL：1 g，批號080703）。胰酶（GIBCO）、Ⅱ型膠原酶（SIGMA）、DMEM HIGH（GIBCO）、胎牛血清（GIBCO）、MTT（SIGMA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康未生育SD大鼠，雌鼠體重250～280 g，共2只，雄鼠體重 280～320 g，共 3只。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2007-0002。乳鼠由上述大鼠孵育（1～3日齡），每次實(shí)驗(yàn)用10只。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺（CLASSⅡ，TypeA/B3）、離心機(jī)（eppendorf J810R）、倒置顯微鏡（OLYM-PUS IX70）、恒溫培養(yǎng)箱（HEPA class100）、酶聯(lián)免疫檢測儀（Synergy HT）。

1.2 方法

1.2.1 藥物的配制 根據(jù)說明書中左卡尼汀的給藥劑量范圍，選取低、中、高三個(gè)劑量，按成人體重60kg，體表面積約為1.5 m2計(jì)算出每千克體重需給藥毫克量，按1×106個(gè)心肌細(xì)胞約為1 g計(jì)算出最終細(xì)胞的低、中、高3個(gè)給藥濃度，將藥物溶于含10%FBS的DMEM中。

1.2.2 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法［5-12］1）心肌細(xì)胞的分離：將乳鼠用75%乙醇消毒皮膚，剪開胸部皮膚，更換手術(shù)器械，開胸，用眼科彎鑷取出心臟，置于PBS中，取完心臟后，剪除心臟周邊組織，并用PBS清洗以去除殘留血液。用眼科剪將其剪成約1 mm3的組織碎塊，加入0.08%胰酶消化約2 min，吸棄上清液，重復(fù)2～3次，向組織塊中加入混合酶（0.08胰酶：0.05%Ⅱ型膠原酶=1：1），37℃孵箱消化約8 min，吸出上清液加入含血清的DMEM中以終止消化，剩余的組織塊加入混合酶繼續(xù)消化，根據(jù)組織塊的量此過程重復(fù)3～4次，至組織塊透明消失為止。用200目篩網(wǎng)過濾收集的細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心8 min，收集細(xì)胞。2）心肌細(xì)胞的純化：將培養(yǎng)液（DMEM HIGH+20%胎牛血清）加入離心后收集細(xì)胞的離心管中，移入培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)1h，除去貼壁的成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104/mL，在細(xì)胞懸液中加入5-溴脫氧尿苷（0.1 mmol），按每孔100 μL接種到96孔培養(yǎng)板，每孔1 mL接種到6孔板，加入1%雙抗（青霉素、鏈霉素）溶液。48 h換液一次，連續(xù)培養(yǎng)4～5 d，待心肌細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞搏動(dòng)穩(wěn)定后，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。3）實(shí)驗(yàn)分組：將培養(yǎng)后穩(wěn)定的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為8組：Ⅰ組為空白對照、Ⅱ組DNR1 μg/mL、Ⅲ組左卡尼汀10 μg/mL、Ⅳ組左卡尼汀20 μg/mL、Ⅴ組左卡尼汀30 μg/mL、Ⅵ組DNR+左卡尼汀10μg/mL、Ⅶ組DNR+左卡尼汀20 μg/mL、Ⅷ組DNR+左卡尼汀30 μg/mL，各組6個(gè)平行孔。

1.2.3 觀察指標(biāo) 上述各組于給藥24 h后，采用MTT法測定細(xì)胞存活率A，采用試劑盒進(jìn)行乳酸脫氫酶（LHD）釋放、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 左卡尼汀對心肌細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果表明，與空白細(xì)胞組相比，隨著左卡尼汀濃度的增加，存活心肌細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞存活率A上升（表1）。

表1 MTT測定結(jié)果（n=6，±s）Table 1 Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay results（n=6，±s）

表1 MTT測定結(jié)果（n=6，±s）Table 1 Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay results（n=6，±s）

No.AⅠⅢⅣⅤC（μg/mL）Blank control group levocarnitine 10 levocarnitine 20 levocarnitine 30 0.398±0.024 0.412±0.042 0.473±0.060 0.500±0.079

2.2 左卡尼汀對DNR損傷心肌細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果表明，左卡尼汀可升高DNR損傷的心肌細(xì)胞的MTT值，Ⅵ～Ⅷ組隨著左卡尼汀濃度的增加，細(xì)胞存活率上升，與DNR損傷組相比有明顯的差別（表2）。

2.3 左卡尼汀對DNR損傷心肌細(xì)胞LDH活性的影響

左卡尼汀能有效減少DNR損傷心肌細(xì)胞的LDH釋放，Ⅵ～Ⅷ各劑量組LDH活力較DNR組明顯降低，表現(xiàn)為良好的劑量依賴性（表2）。

2.4 左卡尼汀對DNR損傷心肌細(xì)胞MDA含量及SOD活性的影響 與空白對照組相比，DNR組心肌細(xì)胞MDA顯著升高，SOD活性顯著下降，Ⅵ～Ⅷ各劑量組均能使MDA含量下降及SOD活性提高（表2）。

表2 MTT 、LDH、MDA、SOD測定結(jié)果（n=6，±s）Table 2 MTT,LDH,MDA,and SOD assay results（n=6，±s）

表2 MTT 、LDH、MDA、SOD測定結(jié)果（n=6，±s）Table 2 MTT,LDH,MDA,and SOD assay results（n=6，±s）

*P＜0.05,compared with the blank control group,**P＜0.05,compared with the DNR control group

No.AⅠⅡⅥⅦⅧC（μg/mL）Blank control group DNR DNR+levocarnitine 10 DNR+levocarnitine 20 DNR+levocarnitine 30 0.398±0.024 0.315±0.012*0.321±0.061**0.366±0.006**0.390±0.006**LDH（U/L）50.5±2.6 108.7±1.7*84.3±3.5**67.2±2.7**60.7±1.9**MDA（nmol/L）2.42±1.23 8.65±1.58*6.11±0.96**4.32±0.98**3.07±0.72**SOD（U/L）35.31±4.09 17.53±3.88*20.81±2.96**29.78±1.89**30.64±2.23**

3 討論

腫瘤藥物的療效和不良反應(yīng)不僅決定于藥物性質(zhì)，在極大程度還決定于治療方案，聯(lián)合用藥、用藥劑量、藥-藥順序、藥-藥間隔、輸注速度等，均可影響治療成敗和不良反應(yīng)高低。細(xì)胞毒藥物所致的心臟不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為；可導(dǎo)致心肌無力、心肌缺血、低血壓、高血壓和心律失常，臨床多是以幾種心臟不良反應(yīng)的混合型表現(xiàn)。導(dǎo)致心臟不良反應(yīng)的主要作用機(jī)制［13-15］：細(xì)胞毒藥物直接致使心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變，使鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞毒藥物進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)干擾多種代謝途徑產(chǎn)生丙二醛，并在心肌細(xì)胞內(nèi)NADPH脫氫酶作用下產(chǎn)生氧自由基，同時(shí)氧自由基在Fe3+的存在下，在心肌細(xì)胞中充當(dāng)氧化劑，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜損傷，破壞心肌細(xì)胞膜的完整性。

為減少不良反應(yīng)，臨床普遍使用各種藥物進(jìn)行預(yù)防，然而這種聯(lián)合用藥的方案缺乏系統(tǒng)的研究。有報(bào)道左卡尼汀可預(yù)防蒽環(huán)類藥物所致的心臟毒性，本實(shí)驗(yàn)也表明DNR對心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用后，細(xì)胞存活率下降，LDH釋放增加，MDA含量增加，SOD活性降低。本研究預(yù)先加入左卡尼汀后，心肌細(xì)胞存活率增加，LDH的釋放減少，MDA含量降低，SOD活性升高，且存在劑量依賴性，這說明左卡尼汀具有抗氧化損傷的能力，可提高自由基清除酶的活性，能保護(hù)心肌細(xì)胞的完整性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，左卡尼汀的加入使存活心肌細(xì)胞的數(shù)量增加，對柔紅霉素所致的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，那么左卡尼汀是否也會(huì)使腫瘤細(xì)胞的存活率升高，從而影響化療藥物的治療作用，還需進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)作進(jìn)一步的研究。

左卡尼汀作為預(yù)防用藥時(shí)，其對腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤藥物的療效是否有影響，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，未見研究報(bào)道。為給臨床提供正確選擇和使用藥物的依據(jù)，減少不良反應(yīng)，還需體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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（2012-11-06收稿）

（2013-01-02修回）

Protective effect of levocarnitine on daunorubicin-induced myocardial cell injury

Yajing LI,Chen WANG
Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Key Laboratory of Cancer Prevention and Treatment of Tianjin City,Tianjin 300060,China

Chen WANG;E-mail:jieyi789@126.com

Objective:This study aimed to determine the protective effect of levocarnitine on myocardial injury caused by daunorubicin(DNR).Methods:Neonatal cardiomyocytes(aged 5 days)from trained Wister rats were randomly divided into the following groups:normal control group,low DNR injury group,and levocarnitine protection group.High-dose DNR was administered and the cardiomyocytes were cultured for 24 h.Cell viability,lactate dehydrogenase(LDH)release,superoxide dismutase(SOD)activity,and malondialdehyde(MDA)content were determined.Results:The levocarnitine dose could significantly improve the survival rate of damaged myocardial cells,inhibit LDH release,and reduce MDAproduction and SOD activity.Conclusion:Levocarnitine exhibited a protective effect on DNRiamycin-induced myocardial cell injury.

levocarnitine injection,daunorubicin,myocardial cells,cardiotoxicity

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.04.004

天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）

*本文課題受2010年天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（編號：2010KZ75）資助

王晨 jieyi789@126.com

This work is supported by the 2010 Science and Technology Funds of Tianjin Municipal Health Bureau(Grant No.2010KZ75)

（本文編輯：鄭莉）