彭金龍 毛 健, 姬中偉 黃桂東 謝廣發(fā) 鄒慧君
(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;2.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江 紹興 312000)
黃酒為世界三大古酒之一,源于中國(guó),唯中國(guó)有之,因其富含糖類、氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、多酚、微量元素、酯類等成份,且易被人體消化吸收,被譽(yù)為“液體蛋糕”[1-3]。千百年來(lái),黃酒主要是采用傳統(tǒng)的陶缸、陶壇作為發(fā)酵容器進(jìn)行的手工作坊式生產(chǎn)[4,5]。但是傳統(tǒng)的依靠自然氣候條件發(fā)酵生產(chǎn)黃酒的過(guò)程,很難控制,從而造成了黃酒產(chǎn)量增長(zhǎng)速度緩慢、各批次品質(zhì)差異較大,這使得機(jī)械化大罐生產(chǎn)黃酒成為黃酒生產(chǎn)工藝革新的必然趨勢(shì)[6],然而大罐生產(chǎn)黃酒的關(guān)鍵技術(shù)還未被完全突破。
發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是對(duì)試驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行定量分析,對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)[7],對(duì)發(fā)酵過(guò)程放大及從分批發(fā)酵過(guò)渡到流加發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵有著重要指導(dǎo)作用的過(guò)程,目前在葡萄酒[8]、醋[9]、秈米酒[10]、櫻桃果酒[11]等生產(chǎn)中已得到了廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)基于對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)反應(yīng)、菌體的新陳代謝機(jī)理等的研究,建立黃酒發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)方程,這將有利于更準(zhǔn)確的掌握、了解黃酒發(fā)酵過(guò)程的各重要參數(shù),對(duì)實(shí)現(xiàn)黃酒發(fā)酵自動(dòng)化具有重要的指導(dǎo)意義。
糯米:購(gòu)于江蘇無(wú)錫;
麥曲:浙江古越龍山紹興酒股份有限公司;
活性干酵母:安琪酵母公司;
其他試劑:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
電子分析天平:FA204N型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;
離心機(jī):4K15型,德國(guó)Sigma公司;
恒溫水浴鍋:HH-S2系列,江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠;
分光光度計(jì):722S型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;
精密pH計(jì):PHS-3C型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;
酒度計(jì):浙江余姚黃家埠玻璃儀表廠;
電熱鼓風(fēng)干燥箱:HG101-2型,南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;
全自動(dòng)控制黃酒專用發(fā)酵罐:BIOTECH 10L型,上海保興生物設(shè)備工程有限公司。
按照機(jī)械化釀造黃酒的工藝釀造黃酒[12],發(fā)酵罐中投料量按照5L發(fā)酵罐配比投料(10L發(fā)酵罐投料相對(duì)5L放大1倍):糯米投料量1kg(室溫浸米24h后蒸飯),釀酒用活性干酵母2g(用2g蔗糖,100mL蒸餾水,40℃活化40min,確保初始酵母菌數(shù)的數(shù)量為107個(gè)/g),加水1.5L(包括700mL米漿水),曲170g(原料米的17%)。前酵溫度為30℃,后酵溫度為15℃。前酵每隔12h取1次樣,后酵每隔24h取1次樣,測(cè)定殘?zhí)菨舛取⒕凭群途w生物量。
向發(fā)酵罐中沖入無(wú)菌空氣將黃酒醪液混勻后,從發(fā)酵罐中取250mL醪液,測(cè)定殘?zhí)菨舛?、酒精度和菌體生物量。按照林巧等所述的細(xì)胞干重法[11]測(cè)定菌體生物量:10mL黃酒醪液3 000r/min離心3min后,上層液體再1 000r/min離心10min,倒去上清液待用,沉淀物(菌體)于105℃烘干至恒重后稱量;另取240mL黃酒發(fā)酵醪液,用雙層紗布過(guò)濾后,濾液3 000r/min離心5min,將離心后的上清液按照GB/T 13662——2008[13]中所述的亞鐵氰化鉀滴定法和蒸餾法測(cè)定殘?zhí)菨舛群途凭取?/p>
使用 Matlab,結(jié)合csape、nlinfit、ppval、fnder軟件,根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù),對(duì)酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程、酒精生成動(dòng)力學(xué)方程和底物糖消耗動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行非線性回歸,求解出模型的參數(shù)。
將釀造黃酒所有原輔料投入到10L發(fā)酵罐中,按照機(jī)械化釀造黃酒工藝釀造黃酒,測(cè)定殘?zhí)菨舛取⒕凭群途w生長(zhǎng)量,所得黃酒發(fā)酵過(guò)程主要物質(zhì)變化曲線見(jiàn)圖1。
圖1 黃酒發(fā)酵過(guò)程主要物質(zhì)變化曲線Figure 1 Metabolic curves of fermentation process of Chinese rice wine
由圖1可知,酵母菌的生長(zhǎng)速度很快,接種后不久便開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)酵母菌發(fā)酵至4d后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期,此時(shí)菌體生物量達(dá)到最高值20.34g/L;7d后,黃酒發(fā)酵液中菌體細(xì)胞進(jìn)入衰亡期,細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境惡化,活細(xì)胞死亡率增加,細(xì)胞濃度迅速降低。對(duì)于產(chǎn)物酒精,其產(chǎn)量在前5d內(nèi)快速增長(zhǎng);5d后黃酒發(fā)酵進(jìn)入后發(fā)酵期,發(fā)酵溫度降為15℃,酵母產(chǎn)酒精也變得緩慢。體系中的總糖因維持菌體生長(zhǎng),形成產(chǎn)物,維持細(xì)胞呼吸新陳代謝作用而不斷消耗,因此不斷減小。
由于黃酒生產(chǎn)周期長(zhǎng),菌體生長(zhǎng)可明顯分為前期(生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期)和后期(衰亡期)兩個(gè)階段,因此采用分段函數(shù)對(duì)菌體生長(zhǎng)狀況進(jìn)行描述。
(1)發(fā)酵前期:Logistic模型是一個(gè)典型的S形曲線方程,廣泛應(yīng)用于發(fā)酵的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程[14],能夠較好地反映發(fā)酵過(guò)程中由于細(xì)胞濃度增加對(duì)其自身所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)。根據(jù)黃酒發(fā)酵特點(diǎn),選用Logistic模型描述菌體細(xì)胞前期的生長(zhǎng)情況,求解各參數(shù):
式中:
X—— 菌體濃度,g/kg·醪液;
μm—— 最大比生長(zhǎng)速率,h-1;
Xm—— 最大菌體濃度,g/L。
對(duì)式(1)兩邊積分得式(2):
根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中的試驗(yàn)數(shù)據(jù),X0=7.37,Xm=20.34及估算值μm=0.135,結(jié)合Logistic模型,使用Ode45,對(duì)微分方程(2)擬合求解得到X0=7.00,Xm=20.29及μm=0.277,并代入方程(2),得:
(2)發(fā)酵7d后,菌體細(xì)胞進(jìn)入衰亡期,在衰亡期細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境惡化,活細(xì)胞死亡速率增加,細(xì)胞濃度迅速降低,在此不作考慮。
黃酒發(fā)酵過(guò)程中,酒精是酵母細(xì)胞代謝的產(chǎn)物,基于此理論,酒精的形成模型應(yīng)該與菌體的質(zhì)量濃度相關(guān)。由此,可采用較為通用的由 Luedeking R 和 Piret EL[15,16]于1959年所提出的數(shù)學(xué)模型:
式中:
α——生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù);
β——非生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù);
p—— 產(chǎn)物濃度,g/L;
對(duì)于酒精生成過(guò)程是與酵母生長(zhǎng)相關(guān)的過(guò)程,因此黃酒發(fā)酵過(guò)程顯然屬于產(chǎn)物部分偶聯(lián)型(α≠0,β≠0)的相關(guān)模型。式(4)兩邊積分得式(5):
通過(guò)軟件擬合得到生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)α=66.10,代入式(5)得到產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型公式:
黃酒發(fā)酵過(guò)程中,底物消耗模型應(yīng)從底物消耗的3個(gè)部分來(lái)考慮:形成產(chǎn)物,供給菌體生長(zhǎng),維持細(xì)胞呼吸新陳代謝作用[17]?;诖嗽?,黃酒發(fā)酵過(guò)程中底物糖消耗模型的建立形式為:
式中:
Yx/s—— 菌體對(duì)底物的得率系數(shù);
Yp/s—— 酒精對(duì)底物的得率系數(shù);
m—— 維持系數(shù),h-1;
S—— 底物濃度,g/L;
底物在細(xì)胞內(nèi)合成產(chǎn)物的模型取決于產(chǎn)物的生成是否與能量代謝過(guò)程相偶聯(lián)。當(dāng)產(chǎn)物的生成是以產(chǎn)能途徑進(jìn)行時(shí),則由于細(xì)胞生長(zhǎng)和維持能,生成產(chǎn)物則是不可避免的,此時(shí)無(wú)單獨(dú)底物流入細(xì)胞用于生成產(chǎn)物,而所生成產(chǎn)物所消耗的底物來(lái)自于用于生長(zhǎng)和維持能的底物,并且消耗于維持能的底物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)作用。對(duì)于酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精這一生理過(guò)程,生產(chǎn)酒精所消耗的底物來(lái)自于細(xì)胞生長(zhǎng)維持能的底物,此時(shí)產(chǎn)物的生成直接與能量的生產(chǎn)相聯(lián)系,因此底物的消耗速率方程不包括單獨(dú)的產(chǎn)物生成項(xiàng),可將原方程化簡(jiǎn)為:
上式兩邊積分得:
黃酒發(fā)酵過(guò)程中,以殘?zhí)呛孔鳛榈孜锵闹笜?biāo),通過(guò)擬合得到模型參數(shù)初始底物濃度S=107.7,底物的細(xì)胞生長(zhǎng)得率系數(shù)Yx/s=0.066 9、維持系數(shù)m =0.193,代入上式得到底物消耗模型為:
按照機(jī)械化釀造黃酒的工藝條件,進(jìn)行黃酒分批發(fā)酵的重復(fù)試驗(yàn),將分批發(fā)酵所得的實(shí)驗(yàn)值與上述參數(shù)代入后得到的動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)的理論值進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表1。比較發(fā)現(xiàn):用動(dòng)力學(xué)模型擬合分批發(fā)酵過(guò)程除極個(gè)別點(diǎn)外,大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)的誤差均小于10%,發(fā)酵終點(diǎn)的糖含量誤差很大,可能是由亞鐵氰化鉀滴定法帶來(lái)的誤差,而且殘?zhí)菨舛然窘咏诹?,可舍去該點(diǎn)。菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和底物消耗的平均相對(duì)偏差分別為8.88%、3.45%和1.58%,表明所擬合的動(dòng)力學(xué)模型較好地反映了實(shí)際的發(fā)酵過(guò)程。
表1 動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值的比較Table 1 Error proof of Dynamics model of pullulan fermentation
本研究分別采用Logistic方程與Luedeking R經(jīng)驗(yàn)方程描述酵母的生長(zhǎng)與酒精合成、底物消耗過(guò)程,建立了黃酒發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)模型、酒精生成模型和底物糖消耗模型,并對(duì)模型加以驗(yàn)證。
通過(guò)對(duì)黃酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,進(jìn)一步了解了黃酒發(fā)酵過(guò)程中微生物生理特征,發(fā)酵過(guò)程中底物消耗和產(chǎn)物形成的規(guī)律,以及各參數(shù)之間的關(guān)系,為黃酒發(fā)酵過(guò)程工藝控制和黃酒大罐發(fā)酵的設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。
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