張海燕 劉忠錦 馮化杰 廉 潔 陳志偉 黃 健
1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,黑龍江齊齊哈爾 161006
阿爾茨海默病是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要病理特征為細胞外老年斑中β淀粉樣蛋白的沉積、細胞內(nèi)由成對的過度磷酸化的Tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1],其病因及發(fā)病機制尚不清楚,多種治療方法目前正在探索中[2]。神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切關(guān)系。而膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家庭中的一名新成員。關(guān)于電針治療AD大鼠海馬GDNF表達的方面比較少,本研究主要觀察電針對AD大鼠海馬PKC和GDNF表達的影響。
清潔級健康Wistar大鼠45只,雄性,體重200~250 g,白求恩醫(yī)大實驗動物中心提供,合格證號2010002,經(jīng)水迷宮測試篩選40只,隨機分為4組:正常組、模型組、西藥組和電針組,正常組常規(guī)飲水和飼料。其余3組大鼠均采用鏈脲霉素(STZ)所致AD模型,模型組造模后不治療。參照華興邦等[3]的大鼠穴位圖譜,電針組針刺雙腎俞(第二腰椎棘突下左、右側(cè)旁開7 mm)、雙足三里(腓骨小頭下約5 mm處)、百會(頂骨正中)、大椎(第七頸椎與第一胸椎間)[4]等穴治療,用 0.25×0.25 mm華佗牌無菌毫針針刺,連接KWD-808全能脈沖電療儀,電壓為2 V,頻率為30 Hz,,強度以肢體局部輕微顫動為適。西藥組采用氫溴酸加蘭他敏灌胃 0.5~1.0 mg/(kg·d),治療 4 周。
氫溴酸加蘭他敏,鏈脲霉素STZ(注射前將STZ溶于0.9%氯化鈉溶液)。PKC免疫組化檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司),GDNF免疫組化檢測試劑盒 (博士德生物工程有限公司),腦立體定位儀,水迷宮,Hans電針儀,Olympus顯微鏡。
10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠,在頭部做正中矢狀切口,坐標(biāo)為腦表面下3.5 mm,前囟1.5 mm,矢狀縫左右旁開1.5 mm。在每側(cè)側(cè)腦室注射10%鏈脲霉素10 μL,創(chuàng)口縫合。3 d后重復(fù)注射一次。
大鼠治療4周后,麻醉后暴露出心臟,左心室插入灌注針頭,快速灌入無菌生理鹽水沖洗組織內(nèi)血液,同時剪開右心耳,沖洗至肝臟變白,然后灌注4%多聚甲醛,當(dāng)大鼠尾巴、四肢僵硬時斷頭取腦,分離海馬[5]。一側(cè)海馬裝入凍存管,一側(cè)置于4%多聚甲醛中,浸泡固定,取海馬標(biāo)本,脫水包埋切片。
PKC、GDNF免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色點狀顆粒,主要分布在胞漿。采集免疫組化染色圖像,用Imagepro-Plus分析軟件進行圖像分析,每張切片區(qū)6個視野測定海馬組織中陽性細胞數(shù),所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0系統(tǒng)處理,數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。
正常組、模型組PKC和GDNF蛋白有較高表達,模型組PKC和GDNF蛋白表達水平顯著降低,治療后西藥組、電針組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 電針對海馬PKC和 GDNF表達的影響(±s,n=10)
表1 電針對海馬PKC和 GDNF表達的影響(±s,n=10)
注:與模型組比較,*P<0.05
組別 海馬PKC陽性細胞數(shù)(個/高倍視野)海馬GDNF表達陽性細胞數(shù)(個/高倍視野)正常組模型組西藥組電針組32.17±13.52*16.26±3.58 28.34±10.68*27.49±11.71*96.31±8.94*72.38±6.15 88.62±7.49*86.73±7.65*
PKC是一類由多種同工酶組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,PKC參與學(xué)習(xí)記憶與影響長時程增強 (longterm potentiation,LTP)的形成有關(guān),在神經(jīng)細胞內(nèi)PKC的激活參與了離子通道的調(diào)節(jié)、受體的失敏、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸傳遞。PKC的激活是突觸可塑性及LTP形成的分子機制之一。Cordey M等[6]研究證明經(jīng)典的PKC亞型能夠阻止Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡。唐勇等[7]電針治療AD大鼠后發(fā)現(xiàn),海馬PKC和酪氨酸蛋白激酶的活性發(fā)生變化,電針治療可能激活蛋白激酶信號通路,從而提高老年癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。星形膠質(zhì)細胞能釋放膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)等大量的活性物質(zhì),可以防止神經(jīng)元凋亡,促進神經(jīng)元修復(fù)和神經(jīng)生長。研究發(fā)現(xiàn)[8]電針治療后的AD大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子表達也顯著增加。本實驗結(jié)果模型組大鼠海馬PKC、GDNF表達降低,經(jīng)治療后電針組表達增加 (P<0.05)。
中醫(yī)學(xué)認(rèn)為老年性癡呆是由于陰陽、氣血、臟腑功能失調(diào)所引起的虛實夾雜的疾病,電針具有促進氣血運行,疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)平衡的特點[9]。本實驗顯示,電針刺激可激活PKC阻止神經(jīng)細胞死亡,從而使膠質(zhì)細胞高表達GDHF mRNA。對AD大鼠海馬GDNF mRNA表達有正向調(diào)節(jié)作用??梢妼p壞的海馬神經(jīng)元有修復(fù)作用,使AD大鼠癡呆癥狀得以改善。這可能是電針能有效地防治老年性癡呆的作用機制。
[1]朱曉冬,蔣希成,毛翔.針刺對D-半乳糖復(fù)制阿爾茨海默病模型大鼠腦組織中 β-AP、Tau 蛋白表達的影響[J].中醫(yī)學(xué)報,2011,26(8):158-159.
[2]邱文興,賈博宇,劉永武,等.通天草提取物對 Aβ1-40所致 AD大鼠血清與海馬組織中細胞因子含量的影響[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(2):24-25.
[3]華興幫,周浩良.大白鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,(1):1-5.
[4]沈峰,杜艷軍,孫國杰,等.電針對Aβ25~35所致AD模型大鼠海馬 cAMP 的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,7(2):117-119.
[5]Xiao-Ping WANG,Hong-Liu DING.Alzheimer's disease: epidemiology,genetics,and beyond[J].Neurosci Bull,April,2008,24(2):105-109.
[6]CordeyM,PikeC.Conventionalprotein kinase C isoforms mediate neuroprotection induced by phorbol ester and estrogen[J].Neurochem,2006,96(1):204-217.
[7]唐勇,余曙光,劉旭光,等.電針激活老年癡呆大鼠海馬蛋白激酶信號通路的作用[J].中國臨床康復(fù),2005,9(1):124-125.
[8]馬駿,王彥春,王述菊,等.電針對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達的影響[J].針灸臨床雜志,2010,26(7):63-66.
[9]趙立剛、馬莉.針灸百會、大椎治療老年性癡呆的療效觀察[J].針灸臨床雜志,2007,23(9):42-43.